Информације

Da li pH utiče na Michaelisovu konstantu?

Da li pH utiče na Michaelisovu konstantu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pokušavao sam da potvrdim Km supstrata (koji je 34 +/- 4 mM). Ova vrednost je dobijena u 50 mM MOPS, pH 6,3. Proveo sam svoj kinetički test u puferu pH 7 i dobio Km vrednost u 21,5. Prema ovom radu, slika 2C, normalizovana specifična aktivnost enzima je oko 70% pri pH 6,3 i oko 47% pri pH 7. Ako podelim 34 mM pri pH 6,3 sa 0,7 (što bi trebalo da dobijem optimalni Km na optimalni pH od 5,5) i zatim pomnožite sa 0,48, onda dobijem 23 mM. Međutim, u radu se kaže da je Km između 30 - 38 mM, pa ako podelim 30 i 38 odvojeno sa 0,7 i pomnožim sa 0,47, dobiću 20 odnosno 25,6 mM. Pošto moja vrednost spada u ovaj opseg, to onda mora da znači da imam pravi enzim i isti rezultat kao papir.

Dakle, moja pitanja su:

  1. Kada papir kaže da je Km "34 +/- 4 mM", mogu li pretpostaviti da to znači da Km može biti bilo gde između 30 - 38 mM? Iznenađen sam kada vidim koliko je širok raspon. Pretpostavio sam da je Km obično samo jedna vrednost sa odstupanjem od najviše 0,1.

  2. Da li pH menja vrednosti Km? Razumem da pH menja oblik(e) enzima i/ili supstrata. Stoga to mora uticati na to koliko želi da se veže za podlogu. Ako se želja enzima da se veže za supstrat smanji zbog povećanja pH, na primer, to bi značilo da je potrebno više supstrata da okruže enzim, čime se povećava Km.

  3. Ako pH promeni Km, da li ovako određujem Km vrednost druge pH vrednosti ako je Km vrednost pri drugom pH već poznata? Znam da su specifična aktivnost i Mihaelisova konstanta različite, ali koliko proizvoda može da se pretvori u minuti zavisi od toga koliko enzim voli da se vezuje za supstrat, što je predstavljeno Mihaelisovom konstantom. Da li su moje rasuđivanje i proračun došli do pravog zaključka? Ako nije, kako se vrši proračun?


Iz izvođenja Michaelis-Menten kinetike možete videti da:

$$K_m=frac{k_f + k_{mačka}}{k_r}$$

Gde su $k_f$ i $k_r$ konstante brzine vezivanja i raskidanja (za vezivanje enzim-supstrat), respektivno, a $k_{cat}$ je broj obrta. Ovo je za aproksimaciju kvazi-stabilnog stanja (QSSA). Za aproksimaciju ravnoteže:

$$K_m=frac{k_f}{k_r}$$ što je isto kao konstanta asocijacije.

U oba slučaja pH može uticati na brzinu vezivanja i odvezivanja utičući na afinitet između enzima i supstrata. Na primer, pretpostavimo da je mesto vezivanja supstrata negativno naelektrisano. Nizak pH bi povećao elektrostatički potencijal mesta vezivanja supstrata ka nuli utičući na jonizaciju funkcionalnih grupa.

pH takođe može imati indirektne efekte na mesto vezivanja supstrata jer može da modifikuje celokupnu strukturu proteina.

Mnoge reakcije katalizovane enzimima uključuju kiselo-baznu katalizu, tj. postoji transfer protona. U reakcijama poput ovih, pH može uticati na $k_{cat}$.

Ako pH promeni Km, da li ovako određujem Km vrednost druge pH vrednosti ako je Km vrednost pri drugom pH već poznata?

To možete učiniti tako što ćete napraviti Lineweaver-Burk grafikon za promenjeni pH.