Информације

Uklanjanje DNK iz ćelije

Uklanjanje DNK iz ćelije


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Možda je glupo pitanje, ali šta se dešava ako se DNK potpuno ukloni iz jednog ćelijskog organizma? Koliko ja znam, DNK je potrebna samo za propagiranje informacija potomcima ako se ukloni iz odrasle ćelije i stavi neki veštački izvor proteina da li će samo izgubiti sposobnost parenja ili će odmah umreti?


To zavisi od statusa i aktivnosti ćelije. Crvena krvna zrnca čiste svoja jezgra i sadržaj DNK i nastavljaju da obavljaju svoju funkciju prilično dobro, iako gube sposobnost da se podele i formiraju nove ćelije (tj. terminalno su diferencirane). Većina ćelija, međutim, zahtevaju od genoma da transkribuje i prevede genetske informacije u protein kako bi održali svoje metaboličke i funkcionalne aktivnosti. Kao što kažete, DNK bi takođe bila potrebna za podelu i izgradnju novih ćelija, tako da bi to bio jedan od glavnih nedostataka uklanjanja celokupne DNK. Dodavanje egzogenih proteina ili aminokiselina neće pomoći u obezbeđivanju ispravne proizvodnje i održavanja proteina, jer su proteini kodirani mRNK koja deluje kao mobilni transkript DNK. Oni zavise od transkripcije DNK, bez koje ne mogu postojati. Proteini se ne formiraju spontano. Ukratko, DNK je skoro uvek apsolutno neophodna, i slučaj je da ako uklonite jezgro iz većine ćelija, one bi umrle vrlo brzo nakon toga.


Metode prenosa gena: 6 metoda

Ovaj članak baca svetlo na šest metoda prenosa gena. Šest metoda su: (1) Transformacija (2) konjugacija (3) elektroporacija (4) Transfer gena posredovan lipozomima (5) Transdukcija i (6) Direktan transfer DNK.

Metod # 1. Transformacija:

Transformacija je metod uvođenja strane DNK u bakterijske ćelije (npr. E.coli). E.coli preuzima plazmidnu DNK u ledeno hladnom CaCl2 (0-5°C), i naknadni toplotni šok (37-45°C oko 90 sekundi). Ovom tehnikom, frekvencija transformacije, koja se odnosi na deo ćelijske populacije koji se može preneti, je prilično dobra, npr. otprilike jedna ćelija za 1000 (10 -3 ) ćelija.

Efikasnost transformacije:

Odnosi se na broj transformanata po mikrogramu dodate DNK. Za E.coli, transformaciju pomoću plazmida, efikasnost transformacije je oko 10 7 do 10 8 ćelija po mikrogramu intaktne plazmidne DNK. Bakterijske ćelije koje mogu preuzeti DNK se smatraju kompetentnim. Kompetencija se može poboljšati promenom uslova rasta.

Mehanizam procesa transformacije nije u potpunosti shvaćen. Veruje se da je CaCI2 utiče na ćelijski zid, lomi se na lokalizovanim regionima, a takođe je odgovoran za vezivanje DNK za ćelijsku površinu. Kratak toplotni šok (tj. nagli porast temperature sa 5°C na 40°C) stimuliše unos DNK. Generalno, DNK velike veličine su manje efikasni u transformaciji.

Druge hemijske metode za transformaciju:

Kalcijum fosfat (umesto CaCI2) je poželjan za transfer DNK u kultivisane ćelije. Ponekad, kalcijum fosfat može dovesti do taloga i toksičnosti za ćelije. Neki radnici koriste dietil amino etil dekstran (DEAE -dekstran) za prenos DNK.

Metod #2. konjugacija:

Konjugacija je prirodni proces mikrobne rekombinacije. Tokom konjugacije, dve žive bakterije (donor i primalac) se spajaju, spajaju se citoplazmatskim mostovima i prenose jednolančanu DNK (od donora do primaoca). Unutar ćelije primaoca, nova DNK se može integrisati sa hromozomom (prilično retko) ili može ostati slobodna (kao što je slučaj sa plazmidima).

Konjugacija se može desiti među ćelijama iz različitih rodova bakterija (npr. ćelije Salmonella i Shigella). Ovo je u suprotnosti sa transformacijom koja se odvija među ćelijama bakterijskog roda. Tako je konjugacijom moguć prenos gena iz dve različite i nepovezane bakterije.

Prirodni fenomen konjugacije se koristi za transfer gena. Ovo se postiže prenošenjem DNK sa plazmidom iz jedne ćelije u drugu. Uopšteno govoreći, plazmidima nedostaju konjugativne funkcije i stoga, kao takvi, nisu sposobni da prenesu DNK na ćelije primaoca. Međutim, neki plazmidi sa konjugativnim svojstvima se mogu pripremiti i koristiti.

Metod #3. Elektroporacija:

Elektroporacija se zasniva na principu da električni impulsi visokog napona mogu indukovati ćelijske plazma membrane da se spoje. Dakle, elektroporacija je tehnika koja uključuje permeabilizaciju membrane posredovanu električnim poljem. Električni udari takođe mogu da izazovu ćelijsko uzimanje egzogene DNK (za koju se veruje da je preko pora formiranih električnim impulsima) iz rastvora za suspendovanje.

Elektroporacija je jednostavna i brza tehnika za unošenje gena u ćelije različitih organizama (mikroorganizama, biljaka i životinja).

Osnovna tehnika elektroporacije za prenos gena u ćelije sisara prikazana je na slici 6.11. Ćelije se stavljaju u rastvor koji sadrži DNK i podvrgavaju se električnim udarima kako bi se izazvale rupe u membranama. Strani fragmenti DNK ulaze kroz rupe u citoplazmu, a zatim u jezgro.

Elektroporacija je efikasan način za transformaciju ćelija E.coli koje sadrže plazmide sa umetnutim DNK dužim od 100 kb. Efikasnost transformacije je oko 10 9 transformanata po mikrogramu DNK za male plazmide (oko 3 kb) i oko 10 6 za velike plazmide (oko 130 kb).

Metod #4. Transfer gena posredovan lipozomima:

Lipozomi su kružni lipidni molekuli, koji imaju vodenu unutrašnjost koja može da nosi nukleinske kiseline. Razvijeno je nekoliko tehnika za inkapsulaciju DNK u lipozome. Prenos gena posredovan lipozomima, koji se naziva lipofekcija, prikazan je na slici 6.12.

Prilikom tretmana DNK fragmenta lipozomima, delovi DNK se inkapsuliraju unutar lipozoma. Ovi lipozomi se mogu zalepiti za ćelijske membrane i spojiti sa njima da bi preneli DNK fragmente. Tako DNK ulazi u ćeliju, a zatim u jezgro. Pozitivno naelektrisani lipozomi veoma efikasno kompleksiraju sa DNK, vezuju se za ćelije i brzo prenose DNK.

Lipofekcija je veoma efikasna tehnika i koristi se za prenos gena u bakterijske, životinjske i biljne ćelije. T

Metod #5. Transdukcija:

Ponekad se strana DNK može upakovati u životinjske viruse. Ovi virusi mogu prirodno inficirati ćelije i uneti DNK u ćelije domaćina. Prenos DNK ovim pristupom se naziva transdukcija.

Metod #6. Direktan transfer DNK:

Moguće je direktno preneti DNK u jezgro ćelije. Mikroinjekcija i bombardovanje česticama su dve tehnike koje se obično koriste u ovu svrhu.

Prenos DNK mikroinjekcijama se generalno koristi za kultivisane ćelije. Ova tehnika je takođe korisna za uvođenje DNK u velike ćelije kao što su oociti, jajašca i ćelije ranih embriona. Termin transfekcija se koristi za prenos DNK u eukariotske ćelije, različitim fizičkim ili hemijskim sredstvima.


37 Kako je DNK raspoređena u ćeliji

DNK je radni molekul, mora se replicirati (kopirati) kada je ćelija spremna za podelu, i mora se „pročitati“ da bi se proizveli molekuli, kao što su proteini, da bi izvršili funkcije ćelije. Iz tog razloga, DNK je zaštićena i upakovana na vrlo specifične načine. Pošto moraju da nose toliko informacija, molekuli DNK mogu biti veoma dugački. Istegnuti od kraja do kraja, molekuli DNK u jednoj ljudskoj ćeliji dostigli bi dužinu od oko 2 metra (otprilike 6 stopa). Dakle, DNK za ćeliju mora biti upakovana na veoma uređen način kako bi se uklopila i funkcionisala unutar strukture (ćelije) koja nije vidljiva golim okom.

Kompletan komplement DNK ćelije naziva se njena genom. Kod prokariota (bakterija), genom se sastoji od jednog, dvolančanog molekula DNK u obliku petlje ili kruga. Region u ćeliji koji sadrži ovaj genetski materijal naziva se a nukleoid (slika 1). Neki prokarioti takođe imaju manje petlje DNK tzv plazmidi koji nisu neophodni za normalan rast.

Слика 1 Prosečna prokariotska ćelija. Imajte na umu da DNK nije okružena membranom da bi stvorila jezgro. Foto kredit Lady of Hats Wikipedia.

Veličina genoma kod jednog od najbolje proučavanih prokariota, ešerihija koli, iznosi 4,6 miliona baznih parova. Ovo bi produžilo rastojanje od oko 1,6 mm ako se rastegne. Uporedite to sa dužinom ćelije E. coli, koja je duga približno 1-2 μm. 1,6 mm = 1600 μm: pa kako se sva ova DNK uklapa u malu ćeliju? DNK je uvrnuta izvan dvostruke spirale u onome što je poznato kao supernamotavanje. Poznato je da su neki proteini uključeni u supersmotanje drugih proteina i enzimi pomažu u održavanju supersmotane strukture.

Eukarioti, kao što su životinje i biljke, imaju hromozomi koji se sastoje od linearnih molekula DNK. Hromozomi se mogu posmatrati kao strukture nalik na niti koje se nalaze unutar jezgra eukariotskih ćelija. Svaki hromozom je napravljen od proteina i jedne linearne dvostruke spirale DNK (Slika 2). Termin hromozom potiče od grčkih reči za boju (hroma) i telo (soma). Naučnici su dali ovo ime hromozomima jer su to ćelijske strukture, ili tela, koja su jako obojena nekim šarenim bojama koje se koriste u istraživanju.

Slika 2 Linearni hromozomi iz pljuvačnih žlezda larvi mušica koje ne grize. Foto kredit Joseph Resichig Wikimedia.

Eukarioti obično imaju mnogo više DNK od prokariota: ljudski genom je otprilike 3 милијарде baznih parova dok je genom E. coli otprilike 4 miliona.Iz tog razloga, eukarioti koriste drugačiji tip strategije pakovanja kako bi uklopili svoju DNK u unutrašnjost језгро (Slika 3). Na najosnovnijem nivou, DNK je omotana oko proteina poznatih kao histons. DNK omotana oko histona obmotava se i slaže kroz nekoliko dodatnih nivoa složenosti. Ove deblje kompaktnije strukture su ono što ste ranije videli na slikama označenim kao „hromozomi“.

Slika 3: Osnovna struktura eukariotskih hromozoma unutar jezgra ćelije (“Chromosomes” od Nacionalnog instituta za istraživanje ljudskog genoma je u javnom vlasništvu)

  • Prokarioti imaju relativno male količine DNK (milioni baznih parova) koji se nalaze u jednom kružnom genomu, koji se nalazi u citoplazmi u nukleoidu.
  • Eukarioti imaju veće količine DNK (milijarde baznih parova) koje se nalaze u nekoliko linearnih hromozoma, koji se nalaze unutar jezgra.

Odgovori i odgovori

Kada saznate sekvencu koja okružuje vaš omiljeni gen, zaista možete pronaći restriktivna mesta koja ga okružuju i izrezati gen. Zatim možete uzeti ovaj izrezani gen i vezati ga za receptivni vektor (poput bakterijskog plazmida).

U zavisnosti od toga koje ste restrikcijske enzime prvobitno koristili (ima ih na hiljade), vaš gen će imati previsoke nukleotide na svojim krajevima. Koristeći ove 'lepljive' krajeve uparujete gen sa vektorom sa komplementarnim lepljivim krajevima. Ligaza se koristi za cementiranje fosfatne kičme gena za plazmid.


Tvoj Gene
TACANNNNCGA
. GTNNNNGCTCG

(Zanemarite tačke, formatiranje neće raditi ako koristim razmake. N=bilo koji nukleotid)

Obratite pažnju na previse TA- i -CG.
TA će se prirodno vezati za pripremljeni vektor sa AT prepustom
CG će se prirodno vezati za pripremljeni vektor sa GC prepustom

Dakle, vektor (poput bakterijskog plazmida) je napravljen da ima komplementarne previse i gen se automatski uparuje sa njim.

Circular -NNN. TACANNNNCGA. GCNNN- Circular
Plazmid -NNNAT. GTNNNNGCTCG. NNN- plazmid

(Opet ignorišite tačke, tretirajte ih kao praznine)

DNK ligaza se koristi za povezivanje fosfatne kičme (koja nije prikazana na ovom jednostavnom primeru) i ligaza dovršava kružnu DNK tako da u DNK nema ureza (koji bi je oslabili).

Sada ovaj plazmid koji nosi vaš gen može biti prepoznat od strane bakterija i kako se ćelija deli bakterija će duplirati gen (i plazmid) sa svakom deobom. U vrlo kratkom vremenskom periodu imaćete milijarde ovih gena.

Nisam upoznat sa biljnom genetikom, ali kao što sam gore pomenuo, postoje bukvalno hiljade restriktivnih mesta (u životinjskoj genetici), tako da enzim koji se koristi zavisi od veličine fragmenta gena koji želite.


DNK dokazi mogu biti izmišljeni, pokazuju naučnici

Naučnici u Izraelu su pokazali da je moguće fabrikovati DNK dokaze, potkopavajući kredibilitet onoga što se smatra zlatnim standardom dokaza u krivičnim predmetima.

Naučnici su napravili uzorke krvi i pljuvačke koji sadrže DNK od osobe koja nije davalac krvi i pljuvačke. Takođe su pokazali da ako imaju pristup DNK profilu u bazi podataka, mogu da konstruišu uzorak DNK koji odgovara tom profilu bez dobijanja bilo kakvog tkiva od te osobe.

„Možete samo da projektujete mesto zločina“, rekao je Dan Frumkin, vodeći autor rada, koji je onlajn objavio časopis Forensic Science International: Genetics. "Svaki student biologije mogao bi ovo da uradi."

Dr Frumkin je osnivač Nukleiksa, kompanije sa sedištem u Tel Avivu koja je razvila test za razlikovanje pravih uzoraka DNK od lažnih koje se nada da će prodati forenzičkim laboratorijama.

Podmetanje fabrikovanih DNK dokaza na mestu zločina samo je jedna implikacija nalaza. Potencijalna invazija na ličnu privatnost je još jedna stvar.

Koristeći neke od istih tehnika, možda je moguće izvući nečiji DNK iz odbačene šolje za piće ili opušaka i pretvoriti ga u uzorak pljuvačke koji bi mogao da se preda kompaniji za genetsko testiranje koja meri poreklo ili rizik od dobijanja raznih bolesti. Poznate ličnosti će možda morati da se plaše „genetskih paparaca“, rekla je Gejl H. Džavit iz Centra za genetiku i javnu politiku na Univerzitetu Džon Hopkins.

Tanija Simončeli, savetnica za nauku u Američkoj uniji za građanske slobode, rekla je da su nalazi zabrinjavajući.

„DNK je mnogo lakše postaviti na mesto zločina nego otiske prstiju“, rekla je ona. „Mi stvaramo sistem krivičnog pravosuđa koji se sve više oslanja na ovu tehnologiju.

Džon M. Batler, vođa projekta testiranja ljudskog identiteta u Nacionalnom institutu za standarde i tehnologiju, rekao je da je „impresioniran koliko su dobro uspeli da fabrikuju lažne DNK profile“. Međutim, dodao je: „Mislim da vaš prosečan kriminalac ne bi mogao da uradi tako nešto.

Naučnici su fabrikovali uzorke DNK na dva načina. Za jedan je bio potreban pravi, iako mali, uzorak DNK, možda iz pramena kose ili šolje za piće. Oni su umnožili mali uzorak u veliku količinu DNK koristeći standardnu ​​tehniku ​​koja se zove amplifikacija celog genoma.

Naravno, šolja za piće ili komad kose može biti ostavljen na mestu zločina da bi nekome podmetnuo, ali krv ili pljuvačka mogu biti verodostojniji.

Autori rada su uzeli krv od žene i centrifugirali je kako bi uklonili bela zrna koja sadrže DNK. Preostalim crvenim zrncima dodali su DNK koja je bila pojačana iz muške kose.

Pošto crvene ćelije ne sadrže DNK, sav genetski materijal u uzorku krvi je od čoveka. Autori su ga poslali u vodeću američku forenzičku laboratoriju, koja ga je analizirala kao da se radi o normalnom uzorku muške krvi.

Druga tehnika se oslanjala na DNK profile, uskladištene u bazama podataka za sprovođenje zakona kao niz brojeva i slova koji odgovaraju varijacijama na 13 tačaka u genomu osobe.

Iz združenog uzorka DNK mnogih ljudi, naučnici su klonirali male DNK isečke koji predstavljaju uobičajene varijante na svakom mestu, stvarajući biblioteku takvih isečaka. Da bi pripremili uzorak DNK koji odgovara bilo kom profilu, samo su pomešali odgovarajuće isečke zajedno. Rekli su da bi biblioteka od 425 različitih DNK isečaka bila dovoljna da pokrije svaki zamislivi profil.

Nukleiksov test da bi se utvrdilo da li je uzorak napravljen oslanja se na činjenicu da pojačana DNK - koja bi se koristila u bilo kojoj obmani - nije metilirana, što znači da mu nedostaju određeni molekuli koji su vezani za DNK na određenim tačkama, obično da bi inaktivirali gene.


CRISPR u životinjama i životinjskim modelima

4.5 Ekstrakcija DNK i amplifikacija biblioteke

Koraci ekstrakcije DNK i PCR amplifikacije su često zanemareni aspekti CRISPR ekrana jer su to uobičajene laboratorijske tehnike. Međutim, ovi koraci se izvode u većem obimu od onoga što obično izvodi prosečan istraživač, što predstavlja jedinstvene izazove. Pošto se mnogi aspekti ovog koraka ne mogu lako proceniti za kontrolu kvaliteta sve dok se ne izvrši sekvenciranje biblioteke, optimizacija može biti dugotrajna i rasipna. Zbog toga se preporučuje korišćenje objavljenih protokola. 53

Ekstrakcija čiste, visokokvalitetne genomske DNK iz velikih količina tumorskog tkiva je neophodna. DNK tumora koja se koristi za PCR amplifikaciju ne mora da sadrži PCR inhibitore ili zagađivače koji bi mogli da spreče tačno određivanje koncentracije DNK. Korišćeni pristup takođe mora biti kompatibilan sa obradom velikih količina polaznog materijala, što favorizuje primenu tehnike zasnovane na padavinama, ali takođe treba napomenuti da se prenošenje mora svesti na minimum.

Treba obratiti pažnju na minimiziranje opterećenja DNK u uzorku pre amplifikacije. Opterećena DNK je masa DNK koja je izvedena iz tkiva osim ćelija raka od interesa. U slučaju bočnih ksenotransplantata, irelevantna teretna DNK mišjeg stromalnog porekla može činiti više od polovine ukupnih nukleinskih kiselina. 87 Treba uložiti napore da se ukloni ova infiltrirajuća stroma. 88 U GEMM, tumorske ćelije — često desetine ili stotine različitih lezija — su pomešane sa parenhimom normalnog organa. Označavanje ovih ćelija fluorescentnim markerom za sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS) preporučuje se da bi se dobila čista populacija tumorskih ćelija. 89


Ekstrakcija DNK - jagoda

Jagode su oktoploidne, što znači da imaju osam setova hromozoma. Procedura za ekstrakciju DNK iz jagode je jednostavna, a rezultati su obično očigledni, lako je videti bele niti DNK unutar ružičastog rastvora soka od jagode.

U ovoj proceduri ćete zgnječiti jagodu i dodati deterdžent i so da razbijete ćelijske zidove i oslobodite DNK unutar jezgra. Zatim ćete filtrirati tečnost iz ove zgnječene jagode u čašu, supstanca se zove filtrat. Filtrat se zatim sipa u epruvetu i preko vrha se sipa sloj alkohola. DNK će zatim precipitirati u sloj alkohola u epruveti

  • Izvucite DNK iz jagode koristeći proizvode za domaćinstvo
  • Identifikujte ulogu hemikalija u procesu ekstrakcije DNK
  • Posmatrajte veliki uzorak DNK

Potrebni materijali:

  • Pufer za ekstrakciju DNK: 1000 ml dejonizovane vode, 50 ml čistog deterdženta za suđe, 1 kašičica soli
  • Jagoda (drugo voće takođe funkcioniše)
  • Ziploc torba
  • Filteri i levci za kafu
  • Epruvete, čaše ili čaše za sakupljanje filtrata

1. Dodajte jagodu (ili polovinu) u Ziploc skladište.
2. Dodajte 10 ml pufera za ekstrakciju DNK i gnječite jagode i pufer oko jednog minuta.
3. Koristite levak i filtere za kafu da filtrirate sok od jagode u čašu.
4. Prebacite filtrat u epruvetu, epruvetu treba napuniti samo do pola i izbegavati prenošenje pene.
5. Polako sipajte ili kapnite hladnim alkoholom preko vrha mešavine jagoda. Želite jedan sloj na mešavini jagoda.
6. Beli pramenovi će se formirati u sloju etanola, koristite štap za mešanje da namotate niti.

Питања за дискусију

1. Kako izgleda DNK iz jagode?

2. Zašto je važno da naučnici mogu da uklone DNK iz ćelija?

3. Koja je uloga deterdženta, etanola i soli u procesu ekstrakcije?

4. Koja je razlika između filtrata i taloga?

4. Ima li DNK u vašoj hrani? Како знаш? Zašto niste povređeni (ili izmenjeni) unosom DNK drugog organizma?

/>Ovo delo je licencirano pod međunarodnom licencom Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0.


Harvardska alatka za uređivanje gena „uvlači se“ DNK u ćelije bez rezanja

CRISPR-Cas9 je revolucionarni alat za uređivanje gena, ali nije bez svojih nedostataka. Sada su naučnici sa Harvarda demonstrirali alternativni sistem genetskog inženjeringa nazvan Retron Library Recombineering (RLR), koji radi bez presecanja DNK i može se brzo primeniti na ogromne populacije ćelija.

CRISPR funkcioniše kao par genetskih makaza, u stanju da izvrši precizne izmene genoma živih ćelija. Sistem može da pronađe određenu sekvencu DNK, a zatim koristi enzim, najčešće Cas9, da napravi rez. Dok ćelija obavlja svoje procedure popravke DNK, CRISPR joj daje uputstva da koristi drugačiju sekvencu umesto originalne, čime uređuje genom.

Ovaj sistem se već pokazuje kao neprocenjiv u nizu primena, od lečenja bolesti poput raka, HIV-a i mišićne distrofije, do kontrole štetočina, poboljšanja useva i izgradnje bioloških računara od bakterija.

Postoje, međutim, potencijalni problemi. Rezanje DNK moglo bi da izazove neke neželjene nuspojave, a izneta je zabrinutost da CRISPR može da izvrši izmene u pogrešnom delu genoma. Takođe može biti malo teško povećati veličinu da biste napravili veće količine izmena odjednom i pratiti koji mutanti imaju koji efekat u laboratorijskim testovima.

Nova tehnologija za uređivanje gena, od istraživača sa Harvardske medicinske škole i Instituta Wyss, pokušava da reši ova pitanja. Glavna razlika RLR-a je u tome što on uopšte ne seče DNK – umesto toga, uvodi novi segment DNK dok ćelija replicira svoj genom pre podele.

Šema koja ilustruje kako funkcioniše nova tehnika za uređivanje gena Retron Library Recombineering (RLR)

To radi pomoću retrona, koji su segmenti bakterijske DNK koji proizvode komade jednolančane DNK (ssDNK). Ispostavilo se da je ovo prvobitno bio mehanizam za samoodbranu koji bakterije koriste da provere da li su zaražene virusom.

Dodavanjem željenog DNK segmenta zajedno sa jednolančanim proteinom za žarenje (SSAP), RLR sistem osigurava da predviđeni segment DNK završi u genomu ćelije ćerke, nakon što se originalna ćelija podeli.

„Mislili smo da bi retroni trebalo da nam daju mogućnost da proizvodimo ssDNK unutar ćelija koje želimo da uredimo, umesto da pokušavamo da ih uteramo u ćeliju spolja, i bez oštećenja nativne DNK, što su obe bile veoma ubedljive kvalitete“, kaže Danijel Goodman, koautor studije.

Novi sistem ima i nekoliko drugih prednosti. Dobro se skalira, omogućavajući da se milioni mutacija proizvode odjednom, a udeo uređenih ćelija se zapravo povećava tokom vremena kako se ćelije repliciraju. Retronska sekvenca se takođe može pratiti kao „bar kod“, što omogućava naučnicima da lako provere koje ćelije su primile koje izmene, kada pokušavaju da prouče efekte.

Rekombiniranje Retron biblioteke (RLR) moglo bi ubrzati laboratorijske eksperimente na genetskim mutacijama u bakterijama

Da bi testirali sistem, istraživači su ga stavili da radi na uređivanju populacije Е. цоли. Koristili su retrone da uvedu gene otpornosti na antibiotike u bakterije, a nakon što su napravili nekoliko drugih podešavanja na bubama kako bi ih sprečili da popravljaju DNK „greške“, otkrili su da je preko 90 procenata populacije ugradilo željenu sekvencu nakon 20 generacija. A zahvaljujući prirodi bar kodova retrona, tim je mogao lako da prati koje su izmene prenele željene gene u genom bakterije.

Iako ima još mnogo posla koji treba da se uradi, tim kaže da bi novi RLR alat mogao imati niz aplikacija. Kratkoročno gledano, to bi moglo biti moćno novo sredstvo za proučavanje bakterijskih genoma i mutacija, potencijalno pomoći u stvaranju novih korisnih sojeva ili otkrivanju mogućnosti lečenja za probleme poput rezistencije na antibiotike. Dugoročno, to može dovesti do sigurnije alternative CRISPR-u kod drugih organizama, čak i kod ljudi.

„Mogućnost analiziranja objedinjenih, bar kodiranih mutantnih biblioteka sa RLR-om omogućava da se milioni eksperimenata izvode istovremeno, omogućavajući nam da posmatramo efekte mutacija širom genoma, kao i kako bi te mutacije mogle da interaguju jedna sa drugom“, kaže Džordž Čerč, viši autor studije. "Ovaj rad pomaže da se uspostavi mapa puta ka korišćenju RLR-a u drugim genetskim sistemima, što otvara mnoge uzbudljive mogućnosti za buduća genetska istraživanja."


Opcije pristupa

Dobijte pun pristup časopisu za 1 godinu

Sve cene su NETO cene.
PDV će biti dodat kasnije pri odlasku.
Obračun poreza će biti finalizovan prilikom plaćanja.

Dobijte vremenski ograničen ili potpun pristup članku na ReadCube-u.

Sve cene su NETO cene.


Koja je svrha soli u ekstrakciji DNK?

Tokom ekstrakcije dezoksiribonukleinske kiseline ili DNK, jedinjenja soli kao što su natrijum acetat i amonijum acetat se obično dodaju da bi se pomoglo u uklanjanju proteina povezanih sa DNK. Druga vrsta soli jedinjenja koja se zove natrijum hlorid ili NaCl, pomaže u očvršćavanju i čini DNK vidljivom. Kada se pomeša u alkoholnom rastvoru, natrijumova komponenta NaCl obezbeđuje zaštitnu barijeru oko negativno naelektrisanih krajeva DNK fosfata, omogućavajući im da se približe kako bi se izvukli iz rastvora.

Ekstrakcija DNK je proces dobijanja čiste DNK iz uzorka, bilo iz živih ili neživih ćelija, kao što su one koje se nalaze u virusima. Ova tehnika se obično koristi u oblasti medicine, gde rano otkrivanje bolesti i poremećaja značajno povećava stopu preživljavanja obolelih pojedinaca.

Metoda u početku zahteva ekstrakciju ćelija koje sadrže DNK. Ćelije se raspadaju podvrgavanjem uzorka ultrazvučnim oscilacijama ili udaranjem kuglica. Uzorku se doda so, koja se centrifugira u rastvoru fenol-hloroforma. Pridruženi proteinski molekuli se zatim izvlače. DNK koja je ostala nakon uklanjanja proteina pomešana je sa rastvorom alkohola, obično hladnim izopropanolom ili etanolom. Rastvor se centrifugira, a DNK, koja se ne rastvara u alkoholu, precipitira i ekstrahuje. Da bi se povećao prinos DNK, ceo proces se mora izvoditi u hladnom okruženju.


Pogledajte video: Šta znači skraćenica DNK (Јануар 2023).