Информације

Da li su Gram negativne bakterije klasifikovane kao takve zbog njihovog negativnog membranskog potencijala?

Da li su Gram negativne bakterije klasifikovane kao takve zbog njihovog negativnog membranskog potencijala?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Da li se membranski potencijal obično navodi za Gram negativne bakterije (на пример., E. coli) односе се на потенцијал на обе мембране? - Ако да, онда да ли потенцијал више пада преко унутрашње или спољашње мембране? Постоје ли студије које процјењују/мјере релативни удио за сваку мембрану?

Pretpostavljam da se merenja potencijala obično vrše ubacivanjem elektrode unutar ćelije i merenjem razlike sa spoljašnošću, ovo bi bilo odgovor na prvo pitanje da.


Кратак одговор
Razlika između gram pozitivnih (gram+) и негативне бактерије (грам-) ima apsolutno ништа у вези са мембранским потенцијалима; све је у вези са Бојење по Граму процедура.

Позадина
Bojenje po Gramu je dobilo ime po danskom bakteriologu Hans Kristijan Gram, који га је првобитно осмислио 1882. (Грам, 1884). Бојење по Граму је уобичајена техника која се користи за разликовање две велике групе бактерија на основу различитих састојака ћелијског зида. Поступак бојења по Граму разликује Грам+ и Грам- групе бојењем ових ћелија у љубичасту или црвену боју (слика 1).

Грам+ bakterije boje ljubičaste boje zbog prisustva debelog sloja peptidoglikan u njihovim Ћелијски зид, који задржава кристално љубичасту боју овим ћелијама. Грам-, с друге стране, мрља црвена, што се приписује тањем зиду пептидогликана, који не задржава кристално љубичасту боју током процеса деколорирања.

Поступак бојења по Граму
Поступак укључује бојење ћелија кристално љубичастом бојом. Затим се додаје раствор јода (јод и калијум јодид) да би се формирао комплекс између кристал љубичице и јода, који је нерастворљив у води. Zatim se uzorku dodaje dekolorizator, kao što je etil alkohol, koji dehidrira sloj peptidoglikana, skupljajući ga i stežući. Кристално-љубичасто-јодни комплекс не може продрети у овај затегнути слој пептидогликана и зато је заробљен у ћелији у Граму+ бактерије. У Граму- бактерија, међутим, тањи слој пептидогликана не задржава комплекс кристал-љубичаста-јод и боја се губи. На крају, узорку се додаје контрабојенка, попут сафранина слабо растворљивог у води, који га боји црвеном бојом. Пошто је сафранин светлије боје од кристално љубичасте, не нарушава љубичасту боју у грамима+ ćelije, ali boji obezbojeni Gram- ћелије црвене.


Slika 1. Gram+ бактерије (лево) и Грам- са десне стране. izvor: Lab Tests Online

Референце
- Грам, Фортсцхритте дер Медизин (1884)


Sledeće nije odgovor na prvobitno pitanje: „Da li su gram negativne bakterije klasifikovane kao takve zbog njihovog negativnog membranskog potencijala?“ већ на питања касније у тексту.


Обично се мембрански потенцијал даје за унутрашњи цитосолни део и ванћелијски простор, за Е. Цоли је око -120 мВ; pogledajte i ovaj članak.

Zbog male veličine E. Coli veoma je teško pouzdano i precizno izmeriti membranski potencijal.

Za periplazmu se navodi samo Donnanov potencijal, on se kreće između 5 i 100 mV, obično oko 25 mV.

Ne znam za bilo koji izveštaj koji meri relativni doprinos, ali pretpostavljam da unutrašnji deo čini najveći deo ukupnog potencijala.


Поглавље 27 - Прокариоти

  • Ako bi ljudi sutra nestali sa planete, život na Zemlji bi se nastavio za većinu drugih vrsta.
  • Ali prokarioti su toliko važni za biosferu da bi, ako bi nestali, izgledi za preživljavanje bilo kojeg drugog života bili slabi.

Prokarioti su nezamenljive karike u reciklaži hemijskih elemenata u ekosistemima.

  • Атоми који сачињавају органске молекуле у свим живим бићима били су једно време део неорганских једињења у тлу, ваздуху и води.
  • Живот зависи од рециклирања хемијских елемената између биолошких и хемијских компоненти екосистема.
    • Прокариоти играју важну улогу у овом процесу.
    • Hemoheterotrofni prokarioti funkcionišu kao razlagači, razgrađujući leševe, mrtvu vegetaciju i otpadne proizvode i otključavaju zalihe ugljenika, azota i drugih elemenata neophodnih za život.
    • Prokarioti takođe posreduju u povratku elemenata iz neživih komponenti životne sredine u bazen organskih jedinjenja.
    • Аутотрофни прокариоти користе угљен -диоксид за стварање органских једињења, која се затим пропуштају кроз ланце хране.
    • Oni su jedini organizmi koji mogu da metabolišu neorganske molekule koji sadrže elemente kao što su gvožđe, sumpor, azot i vodonik.
    • Цијанобактерије не само да синтетишу храну и враћају кисеоник у атмосферу, већ и фиксирају азот.
      • Ово опскрбљује тло и воду азотним једињењима која други организми могу да користе за стварање протеина.

      Многи прокариоти су симбиоти.

      • Prokarioti često stupaju u interakciju sa drugim vrstama prokariota ili eukariota sa komplementarnim metabolizmom.
      • Ekološki odnos između organizama koji su u direktnom kontaktu naziva se simbioza.
        • Ако је један од симбиотских организама већи од другог, назива се домаћин, а мањи је познат као симбионт.
        • Многе од ових врста су узајамни, пробављају храну коју наша црева не могу.
        • Геном укључује велики низ гена укључених у синтезу угљених хидрата, витамина и других хранљивих материја потребних људима.
        • Сигнали из бактерије активирају људске гене који граде мрежу цревних крвних судова неопходних за апсорпцију хране.
        • Drugi signali indukuju ljudske ćelije da proizvode antimikrobna jedinjenja na koja B. thetaiotaomicron nije osetljiva, štiteći bakteriju od konkurenata.

        Концепт 27.5 Прокариоти имају штетан и користан утицај на људе

        • Патогени прокариоти представљају само мали део прокариотских врста.
          • Други прокариоти служе као основно оруђе у пољопривреди и индустрији.
          • Ако се не лечи, лајмска болест може довести до исцрпљујућег артритиса, срчаних обољења и нервних поремећаја.
          • Егзотоксин који производи Вибрио цхолерае изазива колеру, озбиљну болест коју карактерише тешка дијареја.
            • Egzotoksin stimuliše crevne ćelije da otpuste hloridne jone (Cl?) u crevnu vodu nakon čega sledi osmoza.
            • Бактерије које производе ендотоксине из рода Салмонелла обично нису присутне у здравих животиња.
            • Салмонелла типхи изазива тифусну грозницу.
            • Друге врсте салмонела, укључујући и оне које су уобичајене код живине, изазивају тровање храном.
            • Е. цоли је обично безопасан симбионт у људским цревима.
            • Појавили су се патогени сојеви који изазивају крваву дијареју.
              • Jedan od najopasnijih sojeva se zove O157:H7.
              • Данас је то глобална пријетња, са 75.000 случајева годишње само у Сједињеним Државама.
              • Godine 2001. međunarodni tim naučnika je sekvencirao genom O157:H7 i uporedio ga sa genomom bezopasnog soja E. coli.
              • 1.387 од 5.416 гена у О157: Х7 нема пара у безопасном соју.
              • Ovih 1.387 gena mora da je ugrađeno u genom O157:H7 horizontalnim transferom gena, najverovatnije delovanjem bakteriofaga.
              • Многи увезени гени повезани су са инвазијом патогена на домаћина.
              • На пример, неки гени кодирају егзотоксине који омогућавају О157: Х7 да се веже за цревни зид и извлачи хранљиве материје.

              Ljudi koriste prokariote u istraživanju i tehnologiji.

              • Људи су научили да искористе различите метаболичке способности прокариота за научна истраживања и у практичне сврхе.
                • Велики део онога што знамо о метаболизму и молекуларној биологији научили смо користећи прокариоте, посебно Е. цоли, као једноставне моделе система.
                • Prokarioti se sve više koriste za rešavanje ekoloških problema.
                • Najpoznatiji primer je upotreba razlagača prokariota za prečišćavanje ljudske kanalizacije.
                • Anaerobne bakterije razlažu organsku materiju u mulj (čvrsta materija u kanalizaciji), dok aerobni mikrobi to isto čine sa tečnim otpadom.
                • Druge primene bioremedijacije uključuju razbijanje radioaktivnog otpada i čišćenje izlivenog ulja.
                • Други прокариоти могу вадити злато из руде.

                ecture Outline for Campbell/Reece Biology, 7. izdanje, © Pearson Education, Inc. 27-1


                Апстрактан

                Kako, kada i zašto je došlo do prelaza između ćelijskih omotača sa jednom membranom (Gram-pozitivni ili monodermi) i dve (Gram-negativni ili didermi) kod bakterija je ključno pitanje bez odgovora u evolucionoj biologiji. Iznete su različite hipoteze koje sugerišu da je ili monoderm ili fenotip diderma predak. Постојање чланова дидерме у класично монодермним Фирмицутес доводи у питање грам-позитивну/грам-негативну поделу и пружа одличну прилику да се позабави тим питањем. У овом прегледу представљамо тренутно знање о разноликости омотача бактеријских ћелија, укључујући и ове атипичне Фирмикуте. Расправљамо о томе како филогеномска анализа подржава хипотезу да је архитектура омотача ћелије дидерма карактер предака у Фирмицутес -у, и да је фенотип монодерма у овом типу настао више пута независно губитком спољне мембране. S obzirom na ogromnu distribuciju fenotipova diderma u odnosu na one monoderme, ovaj scenario se verovatno proteže na pretka svih bakterija. Na kraju, razgovaramo o nedavnom razvoju genetskih alata za Веиллонелла парвула, diderm Firmicute član ljudskog mikrobioma, što ga ukazuje kao novi eksperimentalni model u nastajanju za istraživanje fundamentalnih aspekata tranzicije diderm/monoderm.


                Sadržaj

                Многи организми унутар врсте Спироцхаетес узрокују преовлађујуће болести. Патогени чланови овог типа укључују следеће:

                • Лептоспира врста, која изазива лептоспирозу [9]
                • Боррелиа бургдорфери, B. garinii, и Б. афзелии, koji izazivaju lajmsku bolest
                • Borrelia recurrentis, што изазива повратну грозницу [10]
                • Treponema pallidum подврсте које изазивају трепонематозе као што су сифилис и рива.
                • Брацхиспира пилосицоли и Брацхиспира аалборги, koji izazivaju crevnu spirohetozu[11]

                Спирохете такође могу изазвати деменцију и могу бити укључене у патогенезу Алцхајмерове болести. [12] Салварсан, први делимично органски синтетички антимикробни лек у историји медицине, био је ефикасан против спирохета и првенствено се користио за лечење сифилиса. Осим тога, познато је да орални спирохети играју значајну улогу у развоју пародонталне болести код људи. [13]

                Класа се тренутно састоји од 14 ваљано именованих родова у 4 реда и 5 породица. [14] [15] [16] Наређења Brachyspirales, Бревинематалес и Лептоспиралес сваки садржи једну породицу, Брацхиспирацеае, Бревинематацеае и Leptospiraceae, редом. Тхе Спироцхаеталес red ima dve porodice, Спироцхаетацеае и Borreliaceae. Молекуларни маркери у облику очуваних индекса потписа (ЦСИ) и ЦСП -а пронађени су специфични за сваки од налога, са изузетком Бревиниметалес, koji obezbeđuju pouzdano sredstvo za razgraničenje ovih kladova jedne od drugih unutar različitih tipova. [15] Пронађене су додатне ЦСИ -јеве које свака породица дели у оквиру Спироцхаеталес. Ovi molekularni markeri su u saglasnosti sa uočenim filogenetskim grananjem stabla dve monofiletske klade unutar Spirochaetales red. [15] Takođe je otkriveno da CSI dodatno razlikuju taksonomske grupe unutar Borreliaceae породице које додатно оцртавају еволуционе односе који су у складу са физичким карактеристикама као што је патогеност (тј. Borrelia ispraviti. Borreliella gen. нема в.). [17] Међутим, ова студија је критикована, а друге студије које користе различите приступе не подржавају предложени расцеп. [18] Нови систем именовања за лајмску и повратну грозницу Borrelia није усвојена у научној литератури. [18]

                Takođe je otkriveno da CSI dele isključivo sve vrste Spirochaetes. [15] Ovaj CSI je umetak od 3 aminokiseline u proteinu štapića bazalnog tela flagela FlgC koji je važan deo jedinstvene endoflagelarne strukture koju dele vrste Spirochaetes. [19] С обзиром на то да ЦСИ деле само чланови овог типа, претпоставља се да се он може повезати са карактеристичним својствима флагела уоченим међу врстама Спироцхаетес. [15] [19]

                Историјски гледано, све породице које припадају врсти Спироцхаетес биле су додељене једном реду, Спироцхаеталес. [7] [8] Међутим, садашње таксономско гледиште више конотира тачне еволуцијске односе. Distribucija CSI ukazuje na zajedničko poreklo unutar klade za koju je specifičan. Stoga funkcioniše kao sinapomorfna karakteristika, tako da distribucije različitih CSI obezbeđuju sredstva za identifikaciju različitih redova i porodica unutar tipa i tako opravdavaju filogenetske podele. [15]

                Филогенија је заснована на ЛС издању 132 заснованом на 16С рРНА заснованом на пројекту Алл-Специес Ливинг Трее Пројецт. [20]


                Биологија ИИ Поглавље 27 - 2

                Организми којима су потребна само неорганска једињења као што је ЦО2 као извор угљеника.

                Фотоаутотрофи (извор енергије: светлост) и хемоаутотрофи (извор енергије: неорганске хемикалије) укључени су у категорију аутотрофа.

                Organizmi kojima je potreban najmanje jedan organski nutrijent, kao što je glukoza, da bi napravili druga organska jedinjenja.

                Оба извора угљеника: органски молекули

                Фотохетеротрофи (Извор енергије: Светлост) и хемохетеротрофи (Извор енергије: Органска једињења) су укључени у ову категорију.

                Обоје захтева светлост као њихов извор енергије.

                • Извор аутоаутотрофа угљеника: ЦО2
                • U ovu kategoriju spadaju fotosintetski prokarioti, biljke i određeni protisti.
                • Извор угљеника фотохетеротрофа: Органска једињења
                • Одређени прокариоти као што су Рходобацтер и Цхлорофлекус спадају у ову категорију.

                Хемоаутотрофи захтевају неорганске хемикалије као извор енергије, док хемохетеротрофи захтевају органска једињења.

                Хемоаутотрофни извор угљеника: ЦО2

                Хемохетеротрофни извор угљеника: органска једињења

                Fotosintetski organizmi koji hvataju svetlosnu energiju i koriste je za pokretanje sistema organskih jedinjenja iz CO2 ili drugih neorganskih ugljeničnih jedinjenja.

                Цијанобактерије и многе друге групе прокариота су фотоаутотрофи, као и биљке и алге.

                Potrebno je samo neorgansko jedinjenje kao što je CO2 kao izvor ugljenika. Међутим, уместо да користе светлост као извор енергије, они оксидирају неорганске супстанце као што су водоник сулфид (Х2С), амонијак (НХ3) или гвожђе јони (Фе2+).

                Ovaj način ishrane je jedinstven za određene prokariote.

                Организам који користи енергију из светлости, али мора да добије угљеник у органском облику.

                Овај начин је јединствен за одређене морске и халофилне (који воле сол) прокариоте.

                Organizam koji mora da potroši organske molekule da bi dobio и енергије и угљеника.

                Овај начин исхране је широко распрострањен међу прокариотима.

                Pretvaranje atmosferskog azota (N2) u amonijak (NH3). Biološku fiksaciju azota vrše određeni prokarioti, od kojih neki imaju uzajamne odnose sa biljkama.

                Azot se tada može pretvoriti u aminokiseline i druge organske molekule.

                Specijalizovana ćelija koja se bavi fiksacijom azota u nekim filamentoznim cijanobakterijama koje se formalno nazivaju heterocista.

                Омогућава метаболичку сарадњу.

                Kolonija koja pokriva površinu jedne ili više vrsta prokariota koji učestvuju u metaboličkoj saradnji.

                Ćelije u biofilmu luče signalne molekule koji regrutuju obližnje ćelije, uzrokujući da kolonije rastu. Ćelije takođe proizvode proteine ​​koji lepe ćelije za supstrat i jednu za drugu.

                Канали у биофилму омогућавају да хранљиве материје дођу до ћелија у унутрашњости и да се отпад избаци.

                Фототроф своју енергију добија из светлости, док хемотроф своју енергију добија из хемијских извора

                Аутотроф црпи угљеник из неорганских извора (често ЦО2), док хетеротроф свој угљеник добија из органских извора.

                Dakle, postoje četiri načina ishrane: fotoautotrofni, fotoheterotrofni (jedinstveni za prokariote), hemoautorofni (jedinstveni za prokariote) i hemoheterotrofni.

                Bakterija se mora oslanjati na hemijske izvore energije pošto nije izložena svetlosti, i mora biti heterotrof ako joj je potreban organski izvor ugljenika, a ne CO2 (ili drugi neorganski izvor, kao što je bikarbonat)

                Прокариот у домену Арцхаеа који живи у тако екстремном окружењу да мало других организама може тамо преживети. Uključuje ekstremne halofile (koji vole so) i ekstremne termofile (toplotu).

                "љубитељи" екстремних услова (пхилос, љубавник)

                • (Хало, со)
                • Prokariot u domenu Archaea koji živi u visoko slanim sredinama kao što su Veliko slano jezero, Mrtvo more i Ovensovo jezero.

                Na primer, proteini i ćelijski zid Халобацтериум имају необичне особине које побољшавају функцију у изузетно сланом окружењу, али чине ове организме неспособним за опстанак ако сланост падне испод 9%.

                Међутим, све је ово релативно.

                Група археја названа по јединственом начину на који добијају енергију. Они користе ЦО2 за оксидацију Х2, ослобађајући метан као отпадни производ. Među najstrožijim anaerobima, metanogeni su trovani O2.

                "Мочварни гас" који се налази у неким мочварама и мочварама производи ове археје. Неке друге врсте метаногена живе у цревима стоке, термита и других биљоједа. Такође се могу користити као разлагачи у постројењима за пречишћавање отпадних вода.

                Хемохетеротрофни прокариоти функционишу као разлагачи. Користе органске молекуле и као извор енергије и као извор угљеника.

                Razlagači su bilo koja od saprobnih gljiva i prokariota koji apsorbuju hranljive materije iz neživog organskog materijala kao što su leševi, otpali biljni materijal i otpad živih organizama i pretvaraju ih u neorganske oblike. Они су детритивори.

                Без деловања прокариота и других разградитеља, попут гљива, сав живот би престао.

                Паразити који могу преживети само у животињским ћелијама, у зависности од домаћина који имају основне ресурсе као што је АТП.

                Грам-негативни зидови кламидије су необични по томе што им недостаје пептидогликан. (Тада слично Археји.)

                Helikalni heterotrofi koji spiralno prolaze kroz svoju okolinu pomoću rotirajućih, unutrašnjih filamenata sličnih biču.

                Многи од њих живе слободно, али други су озлоглашени патогени паразити.

                Fotoautotrofi koji su samo prokarioti sa fotosintezom koja stvara kiseonik.

                Хлоропласти су вероватно настали из ендосимбиотске цијанобактерије.

                I usamljene i kolonijalne cijanobakterije su u izobilju gde god je voda, obezbeđujući ogromnu količinu hrane za slatkovodne i morske ekosisteme.

                Грам-позитивне бактерије у разноликости парирају протеобактеријама. Ово укључује актиномицете, од којих су неке врсте које слободно живе и помажу у разлагању органских материја у тлу.

                Uključujte i usamljene vrste kao npr Бациллус антхрацис, који изазива антракс и Цлостридиум ботулинум, што изазива ботулизам.

                Ovo je velika i raznolika grupa gram-negativnih bakterija koja uključuje fotoautotrofe, hemoautotrofe i heterotrofe.

                Neke proteobakterije su anaerobne, dok su druge aerobne.

                Kategorizovan je u 5 kategorija od alfa do epsilon.

                Ovi prokarioti pretvaraju neorganska jedinjenja u oblike koje mogu preuzeti drugi organizmi, kao što je upotreba CO2 za pravljenje organskih jedinjenja.

                Такође, цијанобактерије производе атмосферски О2, а различити прокариоти фиксирају атмосферски азот у облике које други организми могу користити за прављење градивних блокова протеина и нуклеинских киселина.

                Ekološki odnos između organizama dve različite vrste koje žive zajedno u direktnom i intimnom kontaktu.

                Veći organizam je poznat kao domaćin, a manji je poznat kao simbiont.

                Na primer, ljudska creva su dom za oko 500 do 1.000 vrste bakterija.

                Липополисахаридне компоненте спољне мембране грам-негативних бактерија.

                За разлику од егзотоксина, ендотоксини се ослобађају тек када бактерије умру и њихови ћелијски зидови се сломе.

                • Протеобацтериа
                • Цхламидиас
                • Spirohete
                • Цијанобактерије
                • Gram-pozitivne bakterije

                Протеобактерије су велика и различита класа

                a) gram-pozitivne bakterije
                б) грам-негативне бактерије

                Грам-позитивне бактерије су укључене у своју групу.

                Ова велика и разноврсна група грам-негативних бактерија укључује фотоауторфе, хемоаутотрофе и хетеротрофе.

                Neke proteobakterije su anaerobne, dok su druge aerobne. Filogenetsko stablo ispod pokazuje odnos zasnovan na molekularnim podacima.

                Врсте у једној подгрупи, актиномицете, формирају колоније које садрже разгранате ланце ћелија. Две врсте актиномицета изазивају туберкулозу и губу.

                Међутим, већина актиномицета су слободне врсте које помажу у разлагању органске материје у тлу, а њихове секреције су делимично одговорне за "земљани" мирис богатог тла.

                Грам-негативни зидови хламидије су необични по томе што nedostatak peptidoglikana.

                И појединачне и колонијалне цијанобактерије обилују свуда где има воде, пружајући огромну количину хране за слатководне и морске екосистеме.

                Генетске варијације у популацији бактерија не могу бити резултат

                а) трансдукција
                б) трансформација
                в) коњугација
                g) mutacija
                д) мејоза

                А) светлост као извор енергије и ЦО2 као извор угљеника
                Б) светлост као извор енергије и метан као извор угљеника
                Ц) Н2 као извор енергије и ЦО2 као извор угљеника
                Д) ЦО2 као извор енергије и извор угљеника
                E) H2S kao izvor energije i CO2 kao izvor ugljenika

                Грам-позитивне бактерије се састоје од слободних живих врста које помажу у разлагању органских материја у тлу.

                Fotosinteza slična biljci koja oslobađa O2 se dešava u

                А) цијанобактерије
                B) aktinomicete
                Ц) хемоаутотрофне бактерије
                Д) хламидије
                E) arheje


                Metode

                Бактеријски сојеви и култура

                Све бактерије су купљене из Корејске збирке за културу типова (КЦТЦ, Кореја). E. цоли DH5α, E. цоли K12, E. цоли (KCTC 2571), С. sonnei, K. pneumoniae, С. epidermidis и С. пастери kultivisani su na 37 °C u medijumu LB, С. марцесценс, С. ficaria, С. liquefaciens, E. мори, E. аерогенес, E. цлоацае, Б. мегатеријум, и Б. atrofej uzgajane su na 30 °C u medijumu NB, P. путида, P. pictorum, и С. инсулае узгајане су на 25 ° Ц у ЛБ подлози, E. тхаиландицус, С. thermophilus, L. cypricasei, и L. екуи узгајане су на 37 ° Ц у бујону Лацтобациллус МРС, и L. греи на 37 ° Ц у БХИ подлози. Све ове бактерије су култивисане у аеробним условима до ОД600 od 0,4, nakon čega sledi centrifugiranje (10.000 rpm) 10 minuta na 4 °C i ispiranje dva puta sa Tris-HCl puferom (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 мМ КЦл, 100 мМ НаЦл). Опране бактерије су ресуспендоване у пуферу за везивање (50 мМ Трис, пХ 7,4, 5 мМ МгЦл2, 5 мМ КЦл, 100 мМ НаЦл, 1 мг/мЛ БСА, 0,1 мг/мЛ ДНК сперме лососа, 0,1 мг/мЛ тРНА квасца).

                Грам негативна бактерија Тоггле-Целл СЕЛЕКС

                Сви олигонуклеотиди су набављени од Интегратед ДНА тецхнологи (Цоралвилле, УСА). PAGE prečišćena jednolančana DNK biblioteka sastojala se od N40 рандомизована регија окружена са два 18-нт региона који везују прајмер за ПЦР (5′-АТА ЦЦА ГЦТ ТАТ ТЦА АТТ-Н40-АГА ТАГ ТАА ГТГ ЦАА ТЦТ-3 ′). Следећи прајмер прајмера (5′-АТА ЦЦА ГЦТ ТАТ ТЦА АТТ-3) и обрнути прајмер (5′-АГА ТТГ ЦАЦ ТТА ЦТА ТЦТ-3 ′) коришћени су за квантитативну ПЦР у реалном времену. Обрнути прајмер модификован са поли-А репним испустом (5′-ААА ААА ААААААААААА АА/иСп9 // иСп9/АГА ТТГ ЦАЦ ТТА ЦТА ТЦТ-3 ′) коришћен је за ПЦР у СЕЛЕКС процесу. У првом кругу СЕЛЕКС -а, библиотека ссДНА библиотека (2500 пмол) је денатурисана у везујућем пуферу 5 минута на 95 ° Ц и охлађена на леду 5 минута. Bio je pomešan sa 10 8 broja E. цоли ДХ5α ћелије у везивном пуферу са сталним мућкањем на собној температури 15 мин. SsDNK se vezala za E. цоли ДХ5а је сакупљен при 6.000 о / мин током 5 минута на 4 ° Ц. Vezana ssDNK je odvojena od bakterijskih ćelija eluiranjem u Tris-EDTA puferu (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 5 мМ КЦл, 100 мМ НаЦл) на 95 ° Ц током 5 минута и хлађење на леду 5 минута. СсДНА је после елуције сакупљена на 13.000 о/мин, 4 ° Ц током 5 минута, пречишћена помоћу ПЦИ раствора (Сигма Алдрицх, САД) и исталожена у етанолу укључујући 5 в/в% амонијум ацетата и 1.5 в/в% гликогена. PCR mešavine su napravljene pomoću ssDNA šablona (

                20 нг), 0,4 μМ напредног и поли-А репног прајмера, МиТак реакциони пуфер и 0,25 У Ми Так ДНК полимеразе (Биолине, УК). После ПЦР, продукти реакције су одвојени 10% ПАГЕ гелом у 1Кс ТБЕ (Трис-борат-ЕДТА). Da bi se odvojila zainteresovana ssDNK, izvršena su prečišćavanja gela u UREA-PAGE gelu korišćenjem asimetričnog reverznog prajmera sa poli-A repom. dsDNA PCR proizvod odvojen prajmerom u UREA gelu je odvojen, zagrevan na 65 °C tokom 30 minuta u elucionom puferu (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, 750 mM NH4OAc, 0,1% SDS) i sakupljen u 0,3 M natrijum acetatu i 0,25 μg/μL glikogena (pH 5,2). Zatim je dodato 2,5 zapremine 100% etanola i inkubirano na -80 °C tokom 12 h, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 13.000 rpm, 4 °C tokom 30 min. ДНК пелети су растворени у води и квантификовани коришћењем БиоСпецНано спектрофотометра (СХИМАДЗУ, Јапан). Za sledeći krug selekcije, 100 pmol ssDNK iz prvog kruga je pomešano sa 10 8 ćelija E. цоли К12. Sledeći postupak je bio isti kao gore. Nakon toga, protiv ssDNK je izolovana С. марцесценс а исти поступци су поновљени четири пута (укупно 12 рунди). Након последње рунде, изоловани ссДНА базени су амплификовани комплетом вектора за клонирање РБЦ Т & ампА (Реал Биотецх, Тајван). кандидати за ссДНА аптамер претворени су у компетентне E. цоли DH5α i zatim plazmidna DNK su prečišćeni korišćenjem QIAprep Spin Miniprep kompleta (Qiagen Inc., Nemačka). Sekundarne strukture su računarski predviđene korišćenjem M-fold algoritma (http://mfold.rit.albany.edu) na sobnoj temperaturi, [Na + ] = 100 mM i [Mg 2+ ] = 5 mM.

                Тест обогаћивања везивања применом квантитативне ПЦР у реалном времену

                Standardne kontrole su napravljene serijskim razblaženjem uzoraka. Сваки узорак ссДНА је помешан са 0,2 μМ напредних, обрнутих 18-нт прајмера и СИБР® Премик Ек Так ТМ (ТлиРНасеХ Плус, Такара Био Инц, Јапан), након чега је уследила релативна квантификациона анализа помоћу СтепОне ТМ Реал-Тиме ПЦР система (Апплиед Биосистемс ®, САД) према протоколу произвођача.

                Тестови везивања на бази флуоресценције за аптамере

                Afinitet vezivanja i kapacitet za bakterije su kvantifikovani vezivanjem 3′-FAM obeleženih aptamera za bakterijske ćelije. Za merenje konstanti disocijacije, 108 ćelija bakterijskih vrsta je vezano za različite koncentracije aptamera na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Да би се утврдило да ли су аптамери показали неспецифично везивање за бактерије, исте концентрације негативних контрола као 3′-ФАМ означена Н40 библиотека инкубиране су у истим бактеријама коришћеним горе. Након инкубације, узорци су испрани три пута у Трис пуферу да би се уклонила невезана ссДНА, на 10.000 о / мин, 4 ° Ц током 10 минута. Узорци су ресуспендовани у води, а интензитет њихове флуоресценције мерен је помоћу ВИЦТОР Кс2 Мултилабел Плате Реадер (ПеркинЕлмер, УСА). Константа дисоцијације је мерена нелинеарним регресијским фит фит моделом СигмаПлот12.0. Efikasnost vezivanja ili kapacitet dva odabrana aptamera pri koncentraciji od 250 nM merena je inkubacijom 10 8 i 10 5 ćelija bakterija. Такође је упоређено са оном 340-ФАМ-означене Н40 насумичне ссДНК након инкубације са 10 8 и 10 5 ћелија бактерија.

                Изолација и карактеризација ОМВ -а

                Бактеријске културе узгајане преко ноћи у медијуму су гранулиране при 10.000 о / мин током 30 минута. Фракција супернатанта је филтрирана кроз шприц од 0,45 μм (Мерцк Миллипоре, САД) да би се уклонили преостали остаци ћелија, и концентрисана 50 пута ултрафилтрацијом помоћу 100 кДа Амицон® Ултра-0,5 уређаја (Мерцк Миллипоре). Још једна филтрација је изведена помоћу филтера за шприц 0,22 μм (Мерцк Миллипоре). Zatim, OMV su izolovani ultracentrifugiranjem (Optima MAX-XP, Beckman Coulter, Inc., USA) na 150.000 rpm tokom 3 sata na 4 ° C, resuspendovani u PBS i čuvani na -80 ° C. Концентрације протеина су мерене коришћењем микро БЦА теста (Тхермо Сциентифиц, САД). Да би се проценила расподела величина изолованих ОМВ -ова, спроведено је динамичко распршивање светлости (ДЛС) помоћу Зетасизер Нано ЗС90 (Малверн, УК). Узорци су разблажени 1: 1000 у ПБС -у и обрађени на 25 ° Ц под стандардним подешавањима (индекс преламања диспергента = 1,331, вискозност (цП) = 0,89). За визуализацију везивања између ГН6 и E. цоли ОМ5 ДХ5α, 200 μг магнетних зрна обложених стрептавидином (Динабеадс ™ М-280 Стрептавидин, Тхермо Сциентифиц, САД) и 50 пмол ГН6 аптамера мешани су 30 минута при благом мућкању. Nakon jednog pranja, dodato je 10 μg / mL OMV-a i inkubirano 15 minuta, nakon čega je usledilo nekoliko puta da se uklone nevezani OMV-i. Ови узорци су фиксирани у 2% раствору параформалдехида 2 сата и разблажени у дестилованој води, након чега је уследила имобилизација на чистим силиконским чиповима у условима сушења. Da bi površina bila provodljiva, legura Au-Pd je primenjena prskanjem pre snimanja. СЕМ помоћу ЈСМ-7100Ф је изведен у 2 или 5 кВ енергије снопа.

                Direktna OMV detekcija zasnovana na aptameru

                За ГН6 ЕЛАА користећи бактеријске ОМВ-ове, чврсте плоче Нунц-Иммуно 96 МицроВелл (Тхермо Сциентифиц, САД) су коришћене за имобилизацију ОМВ бактерија у Трис пуферу. Након инкубације ОМВ-а у различитим концентрацијама у плочи преко ноћи на 4 ° Ц, плоча је испрана два пута и блокирана коришћењем 2% пуфера БСА-Трис током 2 сата. Nakon blokiranja, odvojeno je dodato 20 pmol GN6 aptamera i N40 kontrole i inkubirano 1 h. Након испирања 4 пута, додат је стрептавидин-Поли ХРП коњугат (Пиерце, САД) и инкубиран 30 мин. Након темељног испирања 5 пута у Трис пуферу са 0,05% Твеен-20, додат је Ултра ТМБ-ЕЛИСА реагенс (Тхермо Сциентифиц, САД). Posle 15 min, dodat je 1 M sumporna kiselina kao stop rastvor. Apsorpcija na 450 nm je merena korišćenjem Multiskan mikroploče fotometra (Thermo Scientific, SAD). Izmerene vrednosti su analizirane korišćenjem nelinearnog regresionog modela SigmaPlot 12.0.


                Бактеријске инфекције

                Lekari klasifikuju bakterijske infekcije na osnovu različitih načina na koje klasifikuju bakterije. На пример, инфекције се могу класификовати као узроковане грам-негативним или грам-позитивним бактеријама. Ova razlika je važna jer lečenje ova dva tipa može zahtevati različite vrste antibiotika.

                Gram-negativne infekcije укључи следеће:

                Gram-pozitivne infekcije укључи следеће:

                Неке инфекције су класификоване према облику бактерије. На пример, инфекције изазване спирохетама (бактерије у облику спирале) класификују се као спирохетне инфекције.

                Спирохетске инфекције укључи следеће:

                Druge infekcije se mogu klasifikovati prema tome da li bakterije koje ih uzrokuju zahtevaju kiseonik ili uspevaju u okruženju bez kiseonika. Bakterije kojima je potreban kiseonik za život i rast nazivaju se aerobi. Бактерије којима није потребан кисеоник за живот и раст називају се анаероби.

                Anaerobne infekcije укључи следеће:

                Постоји много различитих антибиотика за лечење бактеријских инфекција. Међутим, отпорност бактерија на антибиотике је велика брига.


                Endospore

                Бактеријске ћелије се генерално посматрају као вегетативне ћелије, али неки родови бактерија имају способност стварања ендоспора, структура које у суштини штите бактеријски геном у стању мировања када су услови у окружењу неповољни. Endospore (ne treba ih mešati sa reproduktivnim sporama koje formiraju gljive) omogućavaju nekim bakterijskim ćelijama da prežive duge periode bez hrane ili vode, kao i izloženost hemikalijama, ekstremnim temperaturama, pa čak i zračenju. Tabela (PageIndex<1>) upoređuje karakteristike vegetativnih ćelija i endospora.

                Табела ( ПагеИндек <1> ): Карактеристике вегетативних ћелија у односу на ендоспоре
                Вегетативне ћелије Endospore
                Осетљив на екстремне температуре и зрачење Отпоран на екстремне температуре и зрачење
                Gram-pozitivna Не упијајте Грамову мрљу, само посебне ендоспорне мрље (погледајте Микроскопски узорци за бојење)
                Normal water content and enzymatic activity Dehydrated no metabolic activity
                Capable of active growth and metabolism Dormant no growth or metabolic activity

                The process by which vegetative cells transform into endospores is called sporulation, and it generally begins when nutrients become depleted or environmental conditions become otherwise unfavorable (Figure (PageIndex<9>)). The process begins with the formation of a septum in the vegetative bacterial cell. The septum divides the cell asymmetrically, separating a DNA forespore from the mother cell. The forespore, which will form the core of the endospore, is essentially a copy of the cell&rsquos chromosomes, and is separated from the mother cell by a second membrane. A cortex gradually forms around the forespore by laying down layers of calcium and dipicolinic acid between membranes. A protein spore coat then forms around the cortex while the DNA of the mother cell disintegrates. Further maturation of the endospore occurs with the formation of an outermost exosporium. The endospore is released upon disintegration of the mother cell, completing sporulation.

                Figure (PageIndex<9>): (a) Sporulation begins following asymmetric cell division. The forespore becomes surrounded by a double layer of membrane, a cortex, and a protein spore coat, before being released as a mature endospore upon disintegration of the mother cell. (b) An electron micrograph of a Carboxydothermus hydrogenoformans endospore. (c) These Bacillus spp. cells are undergoing sporulation. The endospores have been visualized using Malachite Green spore stain. (credit b: modification of work by Jonathan Eisen)

                Endospores of certain species have been shown to persist in a dormant state for extended periods of time, up to thousands of years. 2 However, when living conditions improve, endospores undergo germination, reentering a vegetative state. After germination, the cell becomes metabolically active again and is able to carry out all of its normal functions, including growth and cell division.

                The ability to form endospores is restricted to a few genera of Gram-positive bacteria however, there are a number of clinically significant endospore-forming gram-positive bacteria of the genera Бациллус и Clostridium. Ови укључују Б. антхрацис, the causative agent of anthrax, which produces endospores capable of survive for many decades 3 C. tetani (causes tetanus) C. difficile (causes pseudomembranous colitis) C. perfringens (causes gas gangrene) and Ц. ботулинум (causes botulism). Pathogens such as these are particularly difficult to combat because their endospores are so hard to kill. Special sterilization methods for endospore-forming bacteria are discussed in Control of Microbial Growth.


                Options for antimicrobial therapy

                The line of depressing susceptibility findings should not discourage the intensivist from pursuing antibiotic therapy. One merely needs to get a little creative.

                Dosing to MIC

                Just because the lab reports an "R" does not immediately mean that the agent is going to have zero in-vivo activity. For instance, the microbe may be "R" to gentamicin, but gentamicin will be excreted in the urine, where it will reach a concentration hundreds of times in excess of MIC, thereby retaining good activity. This means that in vitro sensitivity profiles may not always be reflected in the clinical response to antibiotics, particularly where the infection is in a particularly susceptible environment. Another example of such an environment is the CSF (where you might like to give the antibiotics directly into the EVD).

                The other natural implication of this is that increasing the dose of the drug will defeat the resistance. This may well be true. Pea et al (2017) used meropenem to treat carbapenemase-producing ESBLs successfully by simply using much more meropenem. Whereas a 2g tds (6g/day) dose already seems excessive in most normal circumstances, the authors threw caution to the wind and gave their patients humongous doses up to 13.2g/day, as continuous infusions (using meropenem levels as a guide) with a median treatment length of 14 days. In case anybody ever wonders how much meropenem is a safe amount, this study gives a good answer. The authors did not report as to whether the patients were growing meropenem crystals in their urine.

                Exotic agents of antimicrobial therapy

                The laboratory does not routinely test for all antimicrobial drugs. There are some which the infectious diseases pharmacist keeps at the back of the antimicrobial pantry, for just these sorts of situations. The following list was compiled after trawling through numerous articles, and should not be viewed as a firm recommendation - this is merely the spectrum of infrequently used agents which might still have activity. The best single reference for novel antibiotics (ones which are on their way towards the market) is probably Zilahi et al (2016).

                • Monobactams
                  • Aztreonam
                  • Temocillin
                  • Mecillinam or pivmecillinam (oral)
                  • Ceftazidime-avibactam
                  • Ceftolozane-tazobactam
                  • Meropenem-vaborbactam
                  • Tebipenem (oral)
                  • Faropenem (oral)
                  • Tigecycline
                  • Eravacycline
                  • Colistin (polymyxin E)
                  • Polymyxin B, whichis more toxic
                  • Amikacin
                  • Plazomicin
                  • Streptomycin
                  • Spectinomycin
                  • Fosfomycin

                  Antibiotic synergy for extremely resistant Gram-negatives

                  An excellent article by Kalan & Wright (2011) describes some of the possible synergies between antibiotics. The article was not specifically discussing resistant Gram-negatives, but the salient features applicable to them have been summarised below. The college in their answer mention that "recommendation is combination antimicrobial therapy" but do not specify whose recommendation that is. Presumably they were not referring to Hawkey et al (2018), as that statement came out approximately two weeks before the written paper. The authors admit that "most of the current evidence for the advantage of combination therapy . derives from observational studies and reports". It is not totally clear that combination therapy is better than monotherapy, and studies tend to come up with wildly different contradictory conclusion, thereby generating some very confused systematic reviews (eg. Paul et al, 2014)

                  Recommended combinations include the following cocktails:

                  • For KPC strains, colistin + meropenem + tigecyline or ceftazidime/avibactam
                  • For OXA strains, aztreonam или ceftazidime/avibactam as monotherapy
                  • For metallo-&beta-carbapenemase producers, colistin + fosfomycin, +/- tigecycline

                  Add colistin to anything. The polymyxin will interfere with the bacteral membrane, making it more permeable to the second agent. This is partiocularly effective if the main reason for drug failure is the presence of efficient efflux pumps or a decreased affinity of the drug for the mutant target. Colistin, trimethoprim and sulfonamides (Simmons, 1970) seems to be a winning combination. Similarly, colistin, tigecycline and a carbapenem (even if there is carbapenemase) works well, at least on the level of case series.

                  Add gentamicin to anything - occasionally, the AAC(60)-Ib enzyme mutation which confers resistance to amikacin spares gentamicin (Gonzalez-Padilla et al, 2014)

                  Use two drugs from the same class. Combination of carbapenems (eg. ertapenem and doripenem together) seems to work for highly resistant carbapenemase producers. Cecarelli et al (2013) found that ertapenem is such a high-affinity substrate for carbapenemase that it could act as a decoy, distracting the enzyme and allowing another carbapenem to do its work.

                  Exotic approaches

                  These are well described by Nigam et al (2014), and because the strategies are highly experimental nobody should mention them in an actual exam answer. They are included here mainly for interest and completeness.

                  Monoclonal antibodies: for example, anti-PcrV: a monoclonal Fab fragment against the type-III secretion system of Pseudomonas, (Milla et al, 2014). This blocks the secretion of bacterial toxin.

                  Pilicides: for example, ZFH04269, which inhibits FimH the type 1 fimbria adhesin, thereby interefering with ability of E.coli to colonise anything (Totiska et al, 2013)

                  Bacteriophage therapy is coming back in vogue (Matsuzaki et al, 2005) the bheaviour of the virus and its "predator-prey" killing knetics tend to favour the use of this therapy for decontamination of biofilms with a low colonisation count (i.e. you would not rely on it to treat a raging sepsis).

                  Бактериоцини are peptides secreted by bacteria to inhibit the growth of other species in the normal course of dog-eat-dog competition which characterises the poor, nasty, brutish lifestyle of microorganisms. Cleveland et al (2001) describes their use in food preservation. Their disadvantages include the potential for resistance (after all it's just another antibiotic) and the fact that as peptides, they are rapidly degraded by peptidases.

                  Killing factors are also secreted by bacteria, but this time to kill neighbouring members of their own species during a time of colony starvation, in effect a form of bacterial cannibalism. So far their use has been largely experimental and theoretical (Liu et al, 2010)

                  Antibiotic effects of non-antibiotic drugs is something to consider- many substances have antibiotic effects in addition to their other "proper" effects. For example, barbiturates, NSAIDs, PPIs, diuretics and beta-blockers all have some antimicrobial effects (Cederlund & Mårdh, 1993). Specific mentions could be made for example amiloride seems to have some good effect on Gram-positive organisms, propanolol kills S.aureus, aspirin kills Клебсиелла and phenothiazine antipsychotics seem to possess broad-spectrum activity against both Gram-positie and Gram-negative organisms. At present no published data exists on on the clinical microbicidal effects of tricyclic antidepressants at above-MIC concentrations (apparently, 150mg/L for amitryptiline), as the management of those patients generally tends to focus on rescuing them from near-lethal tricyclic toxicity.


                  Spirochaetes

                  Spirochaetes are characterized by the presence of a double-membrane and long, spiral-shaped cells that are chemoheterotrophic.

                  Циљеви учења

                  Outline the characteristics associated with spirochaetes and the associated diseases

                  Кључне Такеаваис

                  Кључне тачке

                  • Spirochaetes are chemoheterotrophic in nature and capable of thriving in anaerobic conditions.
                  • The spirochaetes are categorized by the presence of axial filaments which run lengthwise between the inner and outer membranes in periplasmic space.
                  • Spirochaetes are capable of causing diseases including leptospirosis, Lyme disease, relapsing fever and syphilis.

                  Кључни појмови

                  The spirochaetes belong to a phylum of distinctive double-membrane bacteria that are characterized by their long, spiral-shaped cells. The spirochaetes are chemoheterotrophic in nature, free-living and capable of thriving in anaerobic environments. They are often distinguished from other bacterial phyla by the location of their flagella. The flagella, in spirochaetes, runs lengthwise between the inner and outer membranes in the periplasmic space. Often referred to as axial filaments, there is a twisting motion that occurs which allows the spirochaete to move. During reproduction, the spirochaete is capable of undergoing asexual reproduction via binary fission. The binary fission allows for production of two separate spirochaetes.

                  The spirochaetes can be divided into three families which include: Brachyspiraceae, Leptospiraceae, и Spirochaetaceae. These families are all categorized under a single order, Spirochaetales. There are specific species of spirochaetes that are considered to be pathogenic. Some of the pathogenic species include: