Informacije

10: Појачавање и манипулација ДНК фрагментима - Биологија

10: Појачавање и манипулација ДНК фрагментима - Биологија


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

  • 10.1: Uvod u molekularnu genetiku
    Данас се класична генетика често надопуњује молекуларном биологијом, дајући молекуларну генетику, која укључује проучавање ДНК и других макромолекула који су изоловани из организма. Obično eksperimenti molekularne genetike uključuju neku kombinaciju tehnika za izolovanje i analizu DNK ili RNK transkribovanih sa određenog gena.
  • 10.2: Изоловање геномске ДНК
    Strategije prečišćavanja DNK se oslanjaju na hemijska svojstva DNK koja je razlikuju od drugih molekula u ćeliji, naime da je to veoma dugačak, negativno naelektrisan molekul. Da bi se izdvojila prečišćena DNK iz uzorka tkiva, ćelije se razbijaju mlevenjem ili lizom u rastvoru koji sadrži hemikalije koje štite DNK dok ometaju druge komponente ćelije (slika 8.2). Ove hemikalije mogu uključivati ​​deterdžente, koji rastvaraju lipidne membrane i denaturiraju proteine.
  • 10.3: Изоловање или откривање специфичне секвенце помоћу ПЦР -а
    Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је метода репликације ДНК која се изводи у епрувети (тј. Ин витро). Овде се „полимераза“ односи на ензим ДНК полимеразе екстрахован и пречишћен из бактерија, а „ланчана реакција“ се односи на способност ове технике да произведе милионе копија молекула ДНК, користећи сваку ново реплицирану двоструку спиралу као шаблон за синтезу два нове двоструке спирале ДНК. ПЦР је стога врло ефикасна метода амплификације ДНК.
  • 10.4: Порекло молекуларних полиморфизама
    Неке мутације се јављају током процеса репликације ДНК, што резултира уметањем, брисањем или супституцијом једног или неколико нуклеотида. Veće mutacije mogu biti uzrokovane mobilnim genetskim elementima kao što su transpozoni, koji se više ili manje nasumično ubacuju u hromozomsku DNK, ponekad se javljaju u klasterima.
  • 10.5: Класификација и детекција молекуларних маркера
    Мутације које не утичу на функцију протеинских секвенци или експресију гена вероватно ће опстати у популацији као полиморфизми, јер неће бити селекције ни у корист ни против њих (тј. Неутралне су). Имајте на уму да, иако је стопа спонтаних мутација у природним популацијама довољно велика да генерише милионе полиморфизама који се акумулирају током хиљада генерација, стопа мутације је спора.
  • 10.6: Резање и лепљење ДНК-рестрикционих дигестија и лигације ДНК
    Многе бактерије имају ензиме који препознају специфичне ДНК секвенце и затим пресецају дволанчану ДНК спиралу у овој секвенци. Ovi enzimi se nazivaju restrikcijske endonukleaze specifične za mesto, ili jednostavnije „restrikcioni enzimi“, i oni prirodno funkcionišu kao deo odbrane bakterija od virusa i drugih izvora stranog DNK. За сечење ДНК на познатим локацијама, истраживачи користе рестрикционе ензиме из различитих бактеријских врста, а који се могу купити из различитих комерцијалних извора.
  • 10.7: Napravite i pregledajte cDNK biblioteku
    Први корак у стварању библиотеке цДНА је изолација ћелијске мРНК. Овај екстракт мРНА треба да представља све транскрипте у ћелијама у време изолације или ћелијски транскриптом. Овај израз се аналогно користи за геном. Међутим, геном је све генетска информација организма. Nasuprot tome, transkriptom (obično eukariotski) odražava sve gene izražene u datom tipu ćelije u određenom trenutku.
  • 10.8: Sekvenciranje DNK
    РНК секвенцирање је било прво, када је Роберт Холлеи секвенцирао тРНК 1965. Директно секвенцирање тРНА је било могуће јер су тРНК мале, кратке нуклеинске киселине и зато што су многе базе у тРНК хемијски модификоване након транскрипције. Рани метод за секвенцирање ДНК који су развили Валтер Гилберт и колеге укључивао је фрагментацију ДНК, секвенцирање малих фрагмената ДНК, а затим поравнавање преклапајућих секвенци кратких фрагмената за састављање дужих секвенци.
  • 10.9: Genomske biblioteke
    Геномска библиотека може бити епрувета пуна рекомбинантног бактериофага. Сваки молекул ДНК фага садржи фрагментарни уметак ћелијске ДНК из страног организма. Библиотека је направљена тако да садржи приказ свих могућих фрагмената тог генома. Potreba za vektorima poput bakteriofaga koji mogu da prime dugačke umetke postaje očigledna iz sledećeg dela matematike.
  • 10.10: Lančana reakcija polimeraze (PCR)
    Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) може појачати регион ДНК из било ког извора, чак и из ДНК једне ћелије или из фрагмената ДНК добијених из фосила. Ово појачавање обично траје само неколико сати, стварајући милионе копија жељене секвенце циљне ДНК. Efekat je prečišćavanje DNK iz okolnih sekvenci u jednoj reakciji!

Манипулација хидрофобношћу ДНК као универзална стратегија за визуелно биосензирање

Trenutne metode vizuelnog biosensinga, uključujući metode zasnovane na kolorimetriji, fluorescenciji i hemiluminiscenciji, neprikladne su za stotine miliona ljudi pogođenih slepilom za boje i slabošću boje. U poređenju sa ovim dostupnim metodama, strategija zasnovana na kretanju kapljica može biti obećavajući protokol za proširenje na širu bazu korisnika. Ovde izveštavamo o protokolu za manipulisanje hidrofobnošću DNK, koji nudi biosenzibilnu platformu zasnovanu na kretanju kapljica za vizuelnu detekciju malih molekula (ATP), nukleinskih kiselina (mikroRNA) i proteina (trombin). Protokol počinje sa amplifikacijom u obliku kotrljajućeg kruga izazvanom metom koja može lako da generiše kratke jednolančane DNK (ssDNK) fragmente ili dugačke ssDNK. Искоришћавањем макроскопског понашања влажења и молекуларне интеракције, може се прилагодити конформација ссДНА на интерфејсу вода-уље да би се контролисала релевантна хидрофобност ДНК. Влажност ДНК може се превести у визуелне сигнале читањем брзине клизања или критичног угла клизања. Временски распон за цео протокол је ∼1 д, а процес детекције траје ∼1 мин.


Технологије изотермалног појачања нуклеинске киселине: преглед

Технологије амплификације нуклеинске киселине користе се у области молекуларне биологије и технологије рекомбинантне ДНК. Ове технике се користе као водеће методе у откривању и анализи мале количине нуклеинских киселина. Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је најраширенија метода за амплификацију ДНК за откривање и идентификацију заразних болести, генетских поремећаја и друге сврхе истраживања. Међутим, потребна је машина за термоциклирање да одвоји два ланца ДНК и затим појача тражени фрагмент. Нови развој у молекуларној биологији синтезе ДНК ин виво показује могућност амплификације ДНК у изотермним условима без потребе за апаратом за термоциклирање. ДНК полимераза реплицира ДНК уз помоћ различитих помоћних протеина. Недавна идентификација ових протеина омогућила је развој нових ин витро изотермичких метода амплификације ДНК, опонашајући ове ин виво механизме. Постоји неколико врста изотермалних метода амплификације нуклеинске киселине, као што је појачавање посредовано транскрипцијом, амплификација заснована на секвенци нуклеинске киселине, појачање РНА технологије посредовано сигналом, амплификација померања ланаца, амплификација ваљања круга, изотермално појачање ДНК посредовано петљом, изотермичко појачање вишеструким померањем , amplifikacija zavisna od helikaze, izotermna amplifikacija sa jednim prajmerom i kružna amplifikacija zavisna od helikaze. U ovom članku razmatramo ove tehnologije izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina i njihovu primenu u molekularno biološkim studijama.


Резултати

Strategija

In vitro selekcija zahteva ponovljene runde od tri koraka: konverziju gena u proizvode gena, selekciju genskih proizvoda i amplifikaciju gena (Slika 1). Последња два корака, селекција и амплификација, слични су међу свим облицима ин витро селекције. Међутим, конверзија гена у генске производе представља јединствен проблем за ин витро селекцију малих молекула. Dok enzimi pretvaraju genetski materijal u prirodne biopolimere, ne postoji mašina za direktno prevođenje gena u male molekule.

Eksperimenti se započinju sa bibliotekom nukleinskih kiselina (obojena DNK). Секвенца сваког гена усмерава синтезу одговарајућег генског производа (обојена лопта) која је физички повезана са његовом кодирајућом нуклеинском киселином. Proizvodi gena se podvrgavaju selekciji, na primer, vezivanjem za imobilizovani makromolekul (cijan vidžet na dnu). Nukleinska kiselina koja kodira odabrane genske proizvode se amplificira i koristi kao ulaz za naredni ciklus.

Уопштено, библиотеке малих молекула се синтетишу методом сплит-анд-поол која је илустрована на слици 2 (Фурка ет ал. 1991 Тхомпсон и Еллман 1996). Мешавина носача (инертни материјал на коме су изграђени мали молекули, типично полистиренске перле) насумично се дели на потпулове. Različiti hemijski građevinski blok se zatim povezuje sa nosačima u svakom podbazu, nakon čega se nosači spajaju i mešaju. Razdvajanje, spajanje i objedinjavanje se ponavljaju dok se ne završi sinteza biblioteke. Niz podpula u koje se particionira podrška određuje koji hemijski gradivni blokovi se dodaju nosaču. Dakle, putanja koju oslonac prolazi kroz split-and-pool sintezu je u suštini molekularni recept. Ако би носач могао унапред да одреди сопствену путању, он би кодирао синтезу малог молекула који је на крају везан за њега. Предодређивање путања подршке може се постићи коришћењем ДНК библиотеке као материјала за подршку и усмеравањем подела хибридизацијом. ДНК секвенца сваке подлоге тада управља њеним путем подспула и делује као генетски план за мали молекул.

Мешавина чврстих носача (лоптице са ротираним „Л“ на врху) насумично се дели на потпулове. Различити хемијски градивни блокови (црвена, зелена или плава лопта) су повезани са носачима у сваком потпулу. Nosači se ponovo spajaju i mešaju. Ovaj proces razdvajanja, hemije i udruživanja se ponavlja sve dok se sinteza biblioteke ne završi. Mali molekuli koji se na kraju sintetišu su kombinacije različitih građevinskih blokova (obojeni krugovi, kvadrati i dijamanti). Kao što je istaknuto crnom perlom, putanja koju vodi oslonac kroz split-and-pool sintezu (desno, srednje, levo) određuje mali molekul koji se na njemu sintetiše (plava lopta, zeleni kvadrat, crveni dijamant). Број изведених реакција је збир броја потпоолова у сваком подјелу (3 + 3 + 3 = 9). Broj generisanih jedinstvenih malih molekula je proizvod broja podpula u svakoj podeli (3 × 3 × 3 = 27).

Конструкт који смо одабрали за нашу библиотеку за подршку ДНК приказан је на слици 3А. Jednolančana DNK (ssDNK) uključuje jedinstveno reaktivno mesto na svom 5′ kraju, na kome se sintetiše mali molekul. ДНК секвенца садржи 20-базичне „кодоне“ окружене 20-базичним некодирајућим регионима. U okviru biblioteke podrške DNK, degeneracija sekvence postoji na pozicijama kodiranja. Скуп кодона у свакој ДНК подлози специфицира синтезу малих молекула усмеравајући цепање ссДНК у одговарајуће подскупове. Некодирајући региони омогућавају генетску рекомбинацију секвенци подршке помоћу ПЦР (Халпин и Харбури 2004).

(А) Шема која приказује структуру библиотеке за подршку ДНК. Мали молекули се синтетишу на 5 ′ крају гена ссДНА са 340 база. СсДНА се састоји од 20 база-некодираних региона (црне линије означене са З1–З7) и положаје кодирања са 20 база (траке у боји означене [а – ј]1–6). Svi članovi biblioteke sadrže istih sedam DNK sekvenci u sedam nekodirajućih regiona. На сваком од шест позиција кодирања, десет међусобно искључујућих ДНК кодона, (а – ј)н, присутни су, за укупно 60 различитих секвенци. Сваки кодни регион специфицира додавање једне подјединице растућем малом молекулу. Jedinstveno reaktivno mesto (u ovom slučaju primarni amin) za sintezu malih molekula je vezano za 5′ kraj ssDNK preko polietilen glikol linkera (squiggly line). Зрнца смоле обложена олигонуклеотидом комплементарном једном кодону (антикодонске перле, сива лопта десно) хватају хибридизацијом ссДНА које садрже одговарајући кодон.

(Б) Хемијско превођење је синтеза сплит-анд-поол, са цепањем усмереним хибридизацијом ДНК. Библиотека ссДНА је хибридизирана у скуп антикодон колона (сиве кугле) које одговарају скупу кодона присутних на једној позицији кодирања. Гени ссДНА се деле на подскупове на основу идентитета секвенце. Различите хемијске подјединице (обојене лоптице) су повезане са ДНК у сваком потпулу. Коначно, ДНК се поново окупља, довршавајући кодирани додатак једне подјединице растућем малом молекулу. Proces razdvajanja hibridizacije, hemije i udruživanja se ponavlja za sve naredne regione kodiranja.

(C) Šematski proizvod hemijskog prevođenja. Секвенца подјединица малих молекула (обојене лоптице) одговара секвенци кодона (обојене траке) у ссДНА гену.

Наша шема за ДНК усмерено раздвајање и синтезу базена приказана је на слици 3Б. Biblioteka je prvo podeljena hibridizacijom na skup antikodonskih kolona komplementarnih različitim sekvencama od 20 baza koje su prisutne na prvoj poziciji kodiranja. Различити хемијски градивни блокови су повезани са сваким подпулом, а библиотека се поново окупља. Процес се понавља, али је цепање усмерено следећом позицијом кодирања. Свака позиција кодирања садржи скуп кодона који се у низу разликују од кодона на свим осталим положајима кодирања. Сходно томе, цепање је увек усмерено хибридизацијом у једном предвиђеном кодирајућем региону, а не помоћу кодона на другом месту. Мали молекули се синтетишу директно на њиховим кодирајућим ДНК, одржавајући физичку везу између гена и генског производа (слика 3Ц). Директна конверзија гена у генске производе малих молекула, у комбинацији са корацима селекције и амплификације, омогућава ин витро селекцију библиотека малих молекула.

Свођење на праксу

Прво смо развили смолу на бази сефарозе изведену са антикодон олигонуклеотидима комплементарну секвенцама кодона (Халпин и Харбури 2004). Смолу смо тестирали хибридизацијом библиотеке која се састоји од седам ссДНА секвенци у одговарајући скуп од седам различитих антикодон колона (слика 4). Bilo je malo unakrsne hibridizacije, što osigurava da će geni DNK biti tačno prevedeni. Analiza efikasnosti cepanja pomoću scintilacionog brojanja radioaktivno obeležene ssDNK pokazala je da je 90% ili više ulaza ssDNK dobijeno iz ispravnih hibridizacionih kolona za sve testirane sekvence (Halpin i Harbury 2004). Смола је такође робусна. Нисмо приметили губитак ефикасности са преко 30 циклуса хибридизације и елуције.

Sedam serijski skraćenih ssDNK koje se razlikuju po sekvenci na jednoj poziciji kodiranja (ilustrovano levo od gela, naznačen broj baza) hibridizovano je u sedam antikodonskih kolona (cilindri na vrhu gela). Opterećenje (traka 1), protok kroz (traka 2) i eluacije kolone (trake 3–9) analizirani su elektroforezom denaturirajućeg poliakrilamidnog gela.

Затим смо се позабавили хемијском синтезом на незаштићеној ДНК. Употреба чврсте фазе у синтези малих молекула омогућава примену вишка реагенса, за потицање реакција до краја и поједностављује пречишћавање производа (Меррифиелд 1963). Да бисмо остварили ове предности, извели смо синтетичке кораке док је ДНК нековалентно везана за смолу диетиламиноетил (ДЕАЕ) сефарозе (Халпин ет ал. 2004). ДЕАЕ сефароза је изабрана за синтезу у чврстој фази зато што адсорбује ДНК реверзибилно и на начин независан од секвенце и зато што се добро понаша у органским растварачима. Inkubacija imobilizovane DNK sa odgovarajućim reagensima rezultira dodavanjem gradivnog bloka, dovršavajući jedan korak u sintezi malog molekula. Након хемијског корака, ДНК се елуира из чврсте фазе и манипулише у раствору.

Kao početnu hemiju, izabrali smo sintezu peptida zasnovanu na 9-fluorenilmetoksikarbonil [Fmoc]. Slika 5 prikazuje rezultate sinteze peptida u čvrstoj fazi na DNK korišćenjem Fmoc zaštićenih sukcinimidil estara (Anderson et al. 1963 Carpino i Han 1970 Halpin et al. 2004). Sinteza [Leu]enkefalin pentapeptida na aminiranom 20-baznom oligonukleotidu (slika 5B) dala je visoko čist konjugat [Leu]enkefalin-DNK. Unutrašnja kontrola neimenovanog oligonukleotida nije izmenjena od strane hemije, isključujući nespecifičnu hemijsku modifikaciju DNK. Преко 90% опорабљене нуклеинске киселине је намеравани [Леу] енкефалин-ДНК коњугат (укупан обновљени принос био је 60%). Rezultati odgovaraju efikasnosti od 98% za svaki korak spajanja aminokiselina.

(A) Struktura konjugata [Leu]enkefalin–DNK.

(Б) Хроматограф течне хроматографије високих перформанси [Леу] енкефалин пептида синтетизован хемијом сукцинимидил естара на 20-базичном олигонуклеотиду модификованом са 5 ′ примарним амином (20мер). 10-базични олигонуклеотид без 5 'примарног амина (10мер) укључен је у реакције као контрола неспецифичне модификације ДНК. Црвени и плави трагови су ДНК пре и после хемије. Masa pika glavnog proizvoda (vreme zadržavanja od 42 minuta) odgovara očekivanoj masi [Leu]enkefalin-DNK konjugata.

(C) Test pomeranja elektromobilnosti peptida sintetizovanih na 340-baznoj ssDNK. Коњугати су елетрофорисани на нативном агарозном гелу у одсуству (траке 1, 3, 5 и 7) или присуству (траке 2, 4, 6, 8 и 9) антитела 3-Е7 за везивање енкефалина [Леу]. [Леу] енкефалин (Л) или кодирана секвенца (С) синтетизован је на 5 'амино-модификованом 20-базичном олигонуклеотиду, који је касније коришћен као прајмер за ПЦР (стазе 1-4), или директно на 5' амино -modifikovana ssDNK sa 340 baza, koja je kasnije pretvorena u dsDNK (trake 5–9). Dodatak slobodnog [Leu]enkefalin peptida (traka 9) nadmeće se u vezivanju.

Синтеза [Леу] енкефалина на носачу ссДНА са 340 база, способна да кодира синтезу у осам корака, анализирана је коришћењем теста промене електромобилности и енкефалин-специфичног 3-Е7 антитела (Хванг ет ал. 1999). Slika 5C pokazuje da 3-E7 pomera većinu [Leu]enkefalin-DNK (približno 85% kada je standardizovan na pozitivnu kontrolu), pokazujući da se biološka aktivnost peptida održava dok je vezan za DNK.Antitelo 3-E7 ne pomera konjugat peptida kodirane DNK koji sadrži iste aminokiseline kao [Leu]enkefalin, ali drugačijim redosledom. Konačno, slobodni [Leu]enkefalin peptid eliminiše pomeranje [Leu]enkefalin-DNK pomoću 3-E7, pokazujući specifičnost promene.

Наша стратегија превођења хемикалија захтева поновљено цепање усмерено на хибридизацију и спрезање хемијских градивних блокова са ДНК. Za ove zadatke korišćene su dve različite čvrste faze. За ефикасан пренос ДНК са колона са антикодоном на колоне ДЕАЕ Сепхаросе, циклично смо пумпали 50% диметилформамид (ДМФ) преко колона повезаних у низу (слика 6). Suprotno tome, da bismo preneli DNK iz kolona DEAE Sepharose nazad u antikodonske kolone, koristili smo pufer sa visokim sadržajem soli u zatvorenom sistemu. У оба случаја, велика ефективна запремина пуфера тече преко сваке колоне, што омогућава да се процеси преноса ДНК приближе термодинамичкој равнотежи. Ови преноси из колоне у колону уклањају епрувете за складиштење и захтевају мало растварача, минимизирајући губитак ДНК.

Hemijsko prevođenje zahteva ponavljanje hemijskog koraka i dva koraka prenosa u koloni. ssDNK se prenosi sa antikodonskih kolona u kolone DEAE Sepharose cikličnim pumpanjem 50% DMF kroz par kolona (jedna hibridizacija, jedna DEAE) vezanih u seriji tokom 1 h na 45 °C. Хемија се врши на ссДНА везаној за сваку колону ДЕАЕ. ссДНА се преноси из ДЕАЕ колона у антикодонске колоне цикличним пумпањем 1,5-М НаЦл пуфера кроз све ДЕАЕ колоне и све антикодонске колоне повезане са следећом позицијом кодирања током 1 х на 70 ° Ц и 1 х на 46 ° Ц. Efikasnost za svaki korak je označena crvenom bojom.

Ин витро избор хемијски синтетизоване библиотеке

Да бисмо тестирали и потврдили нашу општу стратегију, применили смо ин витро селекцију на примарно неприродну библиотеку пептида, са циљем да идентификујемо лиганд високог афинитета за моноклонско антитело 3-Е7 (Мео ет ал. 1983). Изолација 3-Е7 лиганда је добро дефинисан ин витро проблем селекције који је претходно окарактерисан (Цвирла ет ал. 1990 Барретт ет ал. 1992). Dizajnirali smo našu biblioteku da sadrži najmanje jedan poznati 3-E7 ligand, [Leu]enkefalin. [Леу] енкефалин пептид се везује за 3-Е7 са афинитетом од 7,1 нМ, а његова величина (пет остатака) била је врло погодна за наше експерименте.

Иницијална библиотека за подршку ДНК која се састоји од десет различитих секвенци („све а“, „све б“ итд.) Диверзификована је 10 5 пута ПЦР рекомбинацијом да би се добила библиотека подршке сложености од милион, што је потврђено секвенцирањем ДНК (Халпин и Харбури 2004). Ова библиотека је хемијски преведена у ацилиране пентапептиде користећи Фмоц-заштићене сукцинимидилне естре. Библиотека пептида је укључивала десет различитих мономера на сваком положају (слика 7А). Prvih pet pozicija obuhvatalo je jednu od deset aminokiselina (β-alanin, D-alanin, D-leucin, D-tirozin, 4-nitro-fenilalanin, glicin, leucin, norleucin, fenilalanin ili tirozin). Н-крај је остао немодификован или је ацилован са једном од девет киселина (сирћетна, бензојева, маслачна, капроинска, глутаринска, изобутерна, јантарна, триметилацетна или валерична). Након синтезе библиотеке и конверзије ссДНА у дуплексни облик, библиотека је подвргнута селекцији помоћу 3-Е7 антитела. Одабрана ДНК је ПЦР амплификована и коришћена као улаз за наредну рунду синтезе и селекције.

(А) Грађевински елементи библиотеке. Proteinogeni građevinski blokovi su prikazani zelenom bojom.

(Б) Отприлике 70 ДНК гена из сваког круга селекције је секвенцирано, а резултати су сумирани као графикон хистограма. Оса к означава број аминокиселинских остатака који одговара [Леу] енкефалину кодираном библиотечком секвенцом. Ос и означава генерисање библиотеке (0, почетни материјал 1, након првог круга избора 2, након другог круга избора). З-оса означава број секвенци које кодирају одређени број подударања (к-оса) у одређеној рунди (и-оса).

(Ц) Горњи ред извештава о консензусној секвенци друге библиотеке која се подудара са [Леу] енкефалином. U drugom redu se navodi procenat klonova biblioteke iz dva kruga koji kodiraju [Leu]enkefalin amino kiselinu na svakom položaju ostatka. Treći red izveštava o identitetu i učestalosti najčešće javljane ne-[Leu]enkefalinske podjedinice na svakoj poziciji.

Da bi se pratila konvergencija biblioteke, DNK iz početnog materijala (krug 0) i nakon jedne (krug 1) ili dve (krug 2) selekcijske generacije je subkloniran, a približno 70 različitih izolata iz svake runde je sekvencirano (slika 7B). У колу 0, ниједна секвенца није кодирала више од три заједничка остатка са [Леу] енкефалином. Две секвенце из 1. круга кодирале су пет [Леу] енкефалинских остатака, а једна секвенца кодирала је четири остатка. Od sekvenci 2 kruga, dvadeset kodiranih [Leu]enkefalina pune dužine, trideset četiri kodirana pojedinačna mutanta i jedanaest kodiranih dvostrukih mutanata. Samo tri runde 2 sekvence su kodirale manje od četiri [Leu]enkefalinska ostatka. Консензусна пептидна секвенца другог круга одговара [Леу] енкефалину (слика 7Ц). Претходни рад је показао да су Н-терминални остаци (Тир-Гли-Гли-Пхе) одговорни за већину афинитета [Леу] енкефалина према антителу 3-Е7 (Мео ет ал. 1983 Цвирла ет ал. 1990). Уочили смо очување високе секвенце на овим остацима, рекапитулирајући раније резултате.

Da bismo procenili opštost, sproveli smo drugi eksperiment selekcije [Leu]enkefalina in vitro koristeći biblioteku peptida iste veličine, ali konstruisanu sa potpuno drugačijim „genetskim kodom“. Svaki kodon u alternativnoj biblioteci kodirao je aminokiselinu različitu od one koju je kodirao u prvoj biblioteci. Серија [Леу] енкефалинских кодона у првој библиотеци била је б1-j23-c4-h5-i6, док је у алтернативној библиотеци то био д1-b2-g34-i5-f6. Dva kruga selekcije obogatila su alternativni [Leu]enkefalin DNK gen 10 5 puta (podaci nisu prikazani). Подаци указују на то да у нашем систему постоји мало, ако уопште постоји, пристрасност која кодира ДНК секвенцу која кодира пристрасност. Dalje, oni ilustruju ponovljivost tehnologije. Заједно, резултати убедљиво показују да се стратегија приказивања ДНК може користити за ин витро одабир библиотека синтетичких хемикалија.


Протокол

1. Dizajniranje prajmera

Dizajniranje odgovarajućih prajmera je od suštinskog značaja za uspešan ishod PCR eksperimenta. Приликом дизајнирања низа прајмера за одређено подручје ДНК које је потребно за амплификацију, један прајмер треба да се жари на плус ланац, који је према конвенцији оријентисан у правцу 5 '&#к02192 3' (такође познат као чулни или не шаблонски ланац) а други прајмер треба да допуни минус ланац, који је оријентисан у правцу 3 '&#к02192 5' (антисенс или шаблон). Постоји неколико уобичајених проблема који се јављају при дизајнирању прајмера: 1) само-жарење прајмера што доводи до стварања секундарних структура, попут петљи за укоснице (Slika 1a) 2) пражњење прајмера међусобно, уместо ДНК шаблона, стварајући димер прајмера (Слика 1б) 3) drastično različite temperature topljenja (Tм) za svaki prajmer, što otežava odabir temperature žarenja koja će omogućiti oba prajmera da se efikasno vežu za svoju ciljnu sekvencu tokom tematskog ciklusa (Слика 1ц) (Pogledajte odeljke PRORAČUN TEMPERATURE TOPLJENJA (Tм) и ИЗМЕНЕ УСЛОВА БИЦИКЛИЗМА за више информација о Т.мs).

Испод је листа карактеристика које треба узети у обзир при дизајнирању прајмера.

Дужина прајмера треба да буде 15-30 нуклеотидних остатака (база).

Оптимални садржај Г-Ц треба да се креће између 40-60%.

3' kraj prajmera treba da sadrži G ili C kako bi se prajmer stegnuo i sprečio "disanje" krajeva, povećavajući efikasnost prajminga. До "дисања" ДНК долази када крајеви не остану жарени, већ се распарају или раздвоје. Три водоничне везе у ГЦ паровима спречавају дисање, али и повећавају температуру топљења прајмера.

3 'крајеви комплета прајмера, који укључује прајмер са додатком и минус прајмер, не би требало да се међусобно надопуњују, нити 3' крај једног прајмера може бити комплементаран са другим секвенцама у прајмеру. Ova dva scenarija rezultiraju formiranjem dimera prajmera i struktura petlje ukosnice, respektivno.

Оптималне температуре топљења (Т.м) za prajmere u rasponu između 52-58 ଌ, iako se opseg može proširiti na 45-65 ଌ. Завршни Т.м за оба прајмера не би требало да се разликују за највише 5 &#к000б0Ц.

Treba izbegavati ponavljanja di-nukleotida (npr. GCGCGCGCGC ili ATATATATAT) ili nizove sa jednom bazom (npr. AAAAA ili CCCCC) jer mogu da dovedu do klizanja duž primarnog segmenta DNK i/ili formiranje struktura ukosnice. Ако је то неизбежно због природе ДНК шаблона, онда укључите само понављања или појединачне базе са највише 4 базе.

Napomene:

Postoji mnogo kompjuterskih programa dizajniranih da pomognu u dizajniranju parova prajmera. NCBI Primer alat za dizajn http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ i Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ su preporučene veb stranice za ovu svrhu.

Da bi se izbeglo amplifikovanje srodnih pseudogena ili homologa, moglo bi biti korisno izvršiti eksploziju na NCBI da bi se proverila ciljna specifičnost prajmera.

2. Материјали и реагенси

Приликом постављања ПЦР експеримента важно је бити спреман. Носите рукавице како бисте избегли контаминацију реакционе смеше или реагенса. Uključite negativnu kontrolu i ako je moguće pozitivnu kontrolu.

Rasporedite sve reagense potrebne za PCR eksperiment u sveže napunjenu posudu za led i ostavite da se potpuno odmrznu pre nego što pokrenete reakciju (Slika 2). Држите реагенсе на леду током целог експеримента.

Standardni PCR reagensi uključuju set odgovarajućih prajmera za željeni ciljni gen ili segment DNK koji treba da se amplificira, DNK polimerazu, pufer za specifičnu DNK polimerazu, deoksinukleotide (dNTP), DNK šablon i sterilnu vodu.

Додатни реагенси могу укључивати магнезијумову со Мг 2+ (у крајњој концентрацији од 0,5 до 5,0 мМ), калијумову со К + (у крајњој концентрацији од 35 до 100 мМ), диметилсулфоксид (ДМСО у крајњој концентрацији од 1-10%) , formamid (u konačnoj koncentraciji od 1,25-10%), albumin goveđeg seruma (u konačnoj koncentraciji od 10-100 μg/ml) i betain (u konačnoj koncentraciji od 0,5 M do 2,5 M). О адитивима се даље говори у одељку за решавање проблема.

Organizujte laboratorijsku opremu na radnom stolu.

Materijali uključuju PCR epruvete i poklopce, nosač za PCR epruvete, marker otporan na etanol i set mikropipetora koji daju između 1 - 10 μl (P10), 2 - 20 μl (P20), 20 - 200 & #x003bcl (P200) i 200 - 1000 μl (P1000), kao i termocikler.

Приликом постављања неколико ПЦР експеримената који сви користе исте реагенсе, они се могу одговарајуће скалирати и комбиновати заједно у главну смешу (Мастер Мик). Ovaj korak se može uraditi u sterilnoj epruveti za mikrocentrifugu od 1,8 ml (pogledajte Napomene).

Da bi se analizirali amplikoni dobijeni PCR eksperimentom, potrebni su reagensi i oprema za elektroforezu u agaroznom gelu. Да би се приближила величина ПЦР производа, потребан је одговарајући, комерцијално доступан стандард величине молекуларне тежине.

3. Постављање реакционе смеше

Почните тако што ћете направити табелу реагенаса који ће се додати у реакциону смешу (види Табела 1).

Zatim obeležite PCR epruvetu(e) markerom otpornim na etanol.

Запремине реакција ће варирати у зависности од концентрација основних реагенса. Коначне концентрације (ЦФ) за типичну реакцију од 50 &#к003бцл су следеће.

X pufer (obično ga isporučuje proizvođač DNK polimeraze može sadržati 15 mM MgCl2). Dodajte 5 μl 10X pufera po reakciji.

200 &#к003бцМ дНТП -а (50 &#к003бцМ сваког од четири нуклеотида). Dodajte 1 μl od 10 mM dNTP po reakciji (dATP, dCTP, dTTP i dGTP su po 2,5 mM).

1,5 мМ Мг 2+. Dodajte samo ako nije prisutan u 10X puferu ili ako je potrebno za PCR optimizaciju. На пример, да би се добио 4.0 мМ Мг 2+ потребан за оптималну производњу ампликона очуваног сегмента ДНК од 566 бп пронађених у некарактеристичном микобактериофагу, дода се 8 &#к003бцл од 25 мМ МгЦл2 на реакцију (Слика 3).

20 до 50 пмол сваког прајмера. Dodajte 1 μl od svakih 20 μM prajmera.

Додајте 10 4 до 10 7 молекула (или око 1 до 1000 нг) ДНК шаблона. Додајте 0,5 &#к003бцл 2нг/&#к003бцл геномске ДНК микобактериофага.

Додајте 0,5 до 2,5 јединице ДНК полимеразе на 50 &#к003бцл реакцију (погледајте препоруке произвођача) На пример, додајте 0,5 &#к003бцл Сигма 0,5 јединица/&#к003бцл Так DNK polimeraza.

Додај К.С. sterilnu destilovanu vodu da bi se dobila konačna zapremina od 50 μl po reakciji kao što je unapred određeno u tabeli reagensa (Q.S. je latinska skraćenica za quantum satis što znači količina koja je potrebna). Према томе, потребно је 33 &#к003бцл по реакцији да би се запремина повећала на 50 &#к003бцл. Међутим, треба напоменути да се прво додаје вода, али за почетак је потребно направити табелу реагенаса и одредити запремину свих других реагенса додатих у реакцију.

4. Osnovni PCR protokol

Ставите плочу са 96 јажица у посуду за лед као држач за 0,2 мл ПЦР епрувете са танким зидовима. Omogućavanje dodavanja PCR reagensa u hladne PCR epruvete sa tankim zidovima od 0,2 ml pomoći će u sprečavanju aktivnosti nukleaze i nespecifičnog prajminga.

Pipetirajte sledeće PCR reagense sledećim redosledom u PCR epruvetu sa tankim zidovima od 0,2 ml (Слика 4): Sterilna voda, 10X PCR pufer, dNTPs, MgCl2, прајмере и шаблонску ДНК (види Табела 1). Будући да би експерименти требали имати барем негативну контролу, а могуће и позитивну контролу, корисно је поставити Мастер Мик у епрувету за микроцентрифугу од 1,8 мл (види објашњење у Напоменама).

У засебним епруветама за ПЦР са танким зидовима од 0,2 мл (Слика 4) dodajte sve reagense sa izuzetkom DNK šablona za negativnu kontrolu (povećajte vodu da biste nadoknadili zapreminu koja nedostaje). Pored toga, druga reakcija (ako su reagensi dostupni) treba da sadrži pozitivnu kontrolu korišćenjem šablonske DNK i/ili prajmera za koje je ranije poznato da se amplifikuju pod istim uslovima kao i eksperimentalne PCR epruvete.

Так ДНК полимераза се обично складишти у 50% раствору глицерола и за потпуно распршивање у реакционој смеши потребно је благо мешање ПЦР реагенса пипетирањем горе -доле најмање 20 пута. Mikropipetor treba da bude podešen na oko polovinu reakcione zapremine glavne mešavine prilikom mešanja, i treba voditi računa da se izbegnu unošenje mehurića.

Ставите поклопце на епрувете за ПЦР са танким зидовима од 0,2 мл и ставите их у термички циклер (Слика 5). Kada se poklopac termociklera čvrsto zatvori, pokrenite program (pogledajte Tabela 2).

Када се програм заврши, ПЦР епрувете са 0,2 мл танких зидова могу се уклонити и складиштити на 4 &#к000б0Ц. PCR proizvodi se mogu detektovati unošenjem alikvota svake reakcije u bunarčiće agaroznog gela, a zatim bojenjem DNK koja je migrirala u gel nakon elektroforeze sa etidijum bromidom. Ako je prisutan PCR proizvod, etidijum bromid će se interkalirati između baza lanaca DNK, omogućavajući da se trake vizualizuju pomoću UV osvetljivača.

Napomene:

Prilikom postavljanja više PCR eksperimenata, korisno je sastaviti mešavinu reagenasa zajedničkih za sve reakcije (tj. Master Mix). Обично коктел садржи раствор ДНК полимеразе, дНТП -а, реакционог пуфера и воде састављене у епрувету за микроцентрифугу од 1,8 мл. Količina svakog reagensa dodatog u Master Miks je ekvivalentna ukupnom broju reakcija plus 10% zaokruženo na najbližu celu reakciju. Na primer, ako postoji 10 x 0,1 = 1 reakcija, tada je (10 + 1) x 5 μl 10X pufer jednako 55 μl od 10X pufera za glavni miks. Реагенси у Мастер Мик -у се добро мешају лаганим пумпањем клипа микропипетора горе -доле око 20 пута као што је горе описано. Свака ПЦР епрувета прима аликвот главног микса у који се затим додаје шаблон ДНК, сви потребни прајмери ​​и реагенси специфични за експеримент (види Табеле 1 и 7).

Sledeća veb lokacija nudi kalkulator za određivanje broja kopija DNK šablona (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html). Укупан број копија дволанчане ДНК може се израчунати помоћу следеће једначине: Број копија ДНК = (Количина ДНК (нг) к 6.022к10 23) / (дужина ДНК к 1к10 9 нг / мл к 650 Далтона) Izračunavanje broja kopija DNK se koristi da bi se odredilo koliko je šablona potrebno po reakciji.

Lažno pozitivni rezultati se mogu javiti kao posledica prenosa sa druge PCR reakcije koja bi se vizuelizovala kao višestruki neželjeni proizvodi na agaroznom gelu nakon elektroforeze. Стога је паметно користити одговарајућу технику, укључити негативну контролу (и позитивну контролу када је то могуће).

Dok je etidijum bromid najčešća mrlja za nukleinske kiseline, postoji nekoliko sigurnijih i manje toksičnih alternativa. Следећа веб страница описује неколико алтернатива, укључујући метилен плаво, кристално љубичасто, СИБР безбедно и гел црвено заједно са описима како се користи и открива крајњи производ (хттп://битесизебио.цом/артицлес/етхидиум-бромиде-тхе- alternative/).

Док већина савремених ПЦР машина користи епрувете од 0,2 мл, неки модели могу захтевати реакције у епруветама од 0,5 мл. Погледајте приручник за термичке циклусе да бисте одредили цев одговарајуће величине.

5. Израчунавање температуре топљења (Т.м)

Znajući temperaturu topljenja (Tм) прајмера је императив за успешан ПЦР експеримент. Иако постоји неколико Т.м доступни калкулатори, важно је напоменути да су ови прорачуни процена стварног Т.м zbog nedostatka konkretnih informacija o određenoj reakciji i pretpostavki napravljenim u algoritmima za Tм сами калкулатори. Međutim, termodinamički modeli najbližeg suseda su poželjniji u odnosu na konvencionalnije proračune: Tм &#к02248 4 (Г-Ц) + 2 (А-Т). Први ће дати тачнији Т.м procenu jer uzima u obzir energiju slaganja susednih parova baza. Потоњи се чешће користи јер су прорачуни једноставни и могу се брзо извршити ручно. Погледајте одељак Решавање проблема за информације о томе како различити услови ПЦР -а и адитиви утичу на температуру топљења. Za izračunavanje Tм vrednosti prema termodinamičkim modelima najbližeg suseda, preporučuje se jedan od sledećih kalkulatora: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. Постављање услова термалног бициклизма

ПЦР термални циклуси брзо загревају и хладе реакциону смешу, омогућавајући топлотно индуковану денатурацију дуплексне ДНК (раздвајање ланаца), жарење прајмера на плус и минус нити ДНК шаблона и продужење ПЦР производа.Времена циклуса израчунавају се на основу величине шаблона и садржаја ГЦ у ДНК. Opšta formula počinje sa početnim korakom denaturacije na 94 ଌ do 98 ଌ u zavisnosti od optimalne temperature za aktivnost DNK polimeraze i G-C sadržaja DNK šablona. Tipična reakcija će početi sa denaturacijom od jednog minuta na 94 ଌ. Bilo koje duže od 3 minuta može inaktivirati DNK polimerazu, uništavajući njenu enzimsku aktivnost. Једна метода, позната као ПЦР са топлим покретањем, драстично продужава почетно време денатурације са 3 минута на 9 минута. Са ПЦР-ом са топлим покретањем, ДНА полимераза се додаје након што се заврши почетни корак пренаглашене денатурације. Ova modifikacija protokola izbegava verovatnu inaktivaciju enzima DNK polimeraze. Погледајте одељак Решавање проблема овог протокола за више информација о ПЦР -у са топлим покретањем и другим алтернативним методама.

Sledeći korak je podešavanje termalnog ciklusa da pokrene prvi od 25 do 35 krugova ciklusa temperature u tri koraka (Tabela 2). Dok će povećanje broja ciklusa iznad 35 rezultirati većom količinom PCR proizvoda, previše rundi često dovodi do obogaćivanja nepoželjnih sekundarnih proizvoda. Tri temperaturna koraka u jednom ciklusu postižu tri zadatka: prvi korak denaturira šablon (a u kasnijim ciklusima i amplikone), drugi korak omogućava optimalno žarenje prajmera, a treći korak dozvoljava vezivanje DNK polimeraze za DNK šablon i sintetizuju PCR proizvod. Трајање и температура сваког корака у циклусу могу се променити како би се оптимизирала производња жељеног ампликона. Време за корак денатурације је што је могуће краће. Obično je 10 do 60 sekundi dovoljno za većinu DNK šablona. Време и температура денатурације могу варирати у зависности од садржаја Г-Ц у шаблонској ДНК, као и брзине рампе, што је време потребно термалном циклусу да се промени са једне температуре на другу. Температура за овај корак је обично иста као и она која се користи за почетну фазу денатурације (корак #1 горе, на пример, 94 & #к000б0Ц). У циклусу следи корак жарења од 30 секунди на температури постављеној за око 5 &#к000б0Ц испод очигледног Тм prajmera (idealno između 52 ଌ do 58 ଌ). Ciklus se završava korakom izduživanja. Температура зависи од ДНК полимеразе одабране за експеримент. На пример, Так DNK polimeraza ima optimalnu temperaturu elongacije od 70 ଌ do 80 ଌ i zahteva 1 minut da se produži prva 2 kb, a zatim je potreban dodatni minut za svaki dodatni 1 kb pojačan. Пфу ДНА полимераза је још један термостабилни ензим који има оптималну температуру продужења 75 &#к000б0Ц. Pfu DNK polimeraza se preporučuje za upotrebu u PCR i reakcijama produžetka prajmera koje zahtevaju visoku vernost i zahtevaju 2 minuta za svaki 1 kb da se pojača. Pogledajte preporuke proizvođača za tačne temperature elongacije i vreme istezanja naznačeno za svaku specifičnu DNK polimerazu.

Завршна фаза термичког циклуса укључује продужени период продужења од 5 минута или дуже. Ovaj poslednji korak omogućava da se završi sinteza mnogih nedovršenih amplikona i, u slučaju Так DNK polimeraza, dozvoljava dodavanje ostatka adenina na 3' krajeve svih PCR proizvoda. Ова модификација је посредована терминалном трансферазном активношћу Так ДНК полимеразе и корисна је за накнадне процедуре молекуларног клонирања које захтевају 3'-надвишење.

Završetak reakcije se postiže hlađenjem smeše do 4°C i/ili dodavanjem EDTA do konačne koncentracije od 10 mM.

7. Važna razmatranja prilikom rešavanja problema sa PCR-om

Ако стандардни ПЦР услови не дају жељени ампликон, ПЦР оптимизација је неопходна да би се постигли бољи резултати. Строгост реакције може бити модулирана тако да се специфичност прилагођава променљивим варијаблама (нпр. Концентрације реагенса, услови циклуса) које утичу на исход профила ампликона. На пример, ако реакција није довољно оштра, генерисаће се многи лажни ампликони променљиве дужине. Ako je reakcija suviše stroga, proizvod neće biti proizveden. Rešavanje problema sa PCR reakcijama ponekad može biti frustrirajući poduhvat. Međutim, pažljiva analiza i dobro razumevanje reagensa koji se koriste u PCR eksperimentu mogu smanjiti količinu vremena i pokušaja potrebnih za dobijanje željenih rezultata. Од свих разматрања која утичу на строгоћу ПЦР -а, титрација Мг 2+ и/или манипулација температурама жарења вероватно ће решити већину проблема. Међутим, пре него што било шта промените, уверите се да до погрешног резултата није дошло због људске грешке. Počnite tako što ćete potvrditi da su svi reagensi dodati u datu reakciju i da reagensi nisu kontaminirani. Узмите у обзир и погрешан резултат и поставите следећа питања: Да ли су димери прајмера видљиви на гелу након електрофорезе (они теку као мале траке &#к0003ц100 б при дну траке)? Da li postoje nespecifični proizvodi (trake koje migriraju u različitoj veličini od željenog proizvoda)? Da li je nedostajao neki proizvod? Da li je ciljna DNK na plazmidu ili u ekstraktu genomske DNK? Takođe, mudro je analizirati G-C sadržaj željenog amplikona.

Прво утврдите да ли је неки од ПЦР реагенса катастрофалан за вашу реакцију. То се може постићи припремом нових реагенса (нпр. Свеже радне залихе, нова разблажења), а затим систематским додавањем једног по једног реагенса у реакционе смеше. Ovaj proces će odrediti koji je reagens krivac za neuspeli PCR eksperiment. У случају врло старе ДНК, која често акумулира инхибиторе, показано је да додавање говеђег серумског албумина може помоћи у ублажавању проблема.

Димери прајмера могу настати када се прајмери ​​првенствено самозапаљују или жаре у односу на други прајмер у реакцији. Ако се то догоди, на агарозном гелу ће се појавити мали производ мањи од 100 бп. Počnite tako što ćete promeniti odnos šablona i prajmera ako je koncentracija prajmera u ekstremnom višku u odnosu na koncentraciju šablona, ​​tada će verovatnije da će se prajmeri spojiti sami sa sobom ili jedan sa drugim preko DNK šablona. Dodavanje DMSO-a i/ili korišćenje metode termičkog ciklusa sa vrućim startom može rešiti problem. На крају ће можда бити потребно дизајнирати нове прајмере.

Nespecifični proizvodi se proizvode kada je PCR strogost preterano niska što rezultira nespecifičnim PCR trakama promenljive dužine. Ово производи ефекат мердевина на агарозном гелу. Tada je preporučljivo izabrati PCR uslove koji povećavaju strogost. Razmaz različitih veličina takođe može biti rezultat prajmera dizajniranih za veoma repetitivne sekvence kada se pojačava genomska DNK. Међутим, исти прајмери ​​могу појачати циљну секвенцу на плазмиду без наилажења на исти проблем.

Nedostatak PCR proizvoda je verovatno zbog uslova reakcije koji su prestrogi. Dimeri prajmera i strukture petlje za ukosnicu koje se formiraju sa prajmerima ili u denaturisanoj šablonskoj DNK takođe mogu sprečiti amplifikaciju PCR proizvoda jer se ovi molekuli možda više ne uparuju u bazi sa željenim parom DNK.

Ако садржај Г-Ц није анализиран, време је да то учините. ПЦР региона богатих Г-Ц (садржај ГЦ &#к0003е60%) представља неке од највећих изазова за ПЦР. Međutim, postoji mnogo aditiva koji su korišćeni da pomognu u ublažavanju izazova.

8. Manipulisanje PCR reagensima

Разумевање функције реагенса који се користе на конвенционалној ПЦР критично је при првом одлучивању о томе како најбоље променити услове реакције да би се добио жељени производ. Успех се једноставно може ослањати на промену концентрације МгЦл2, КЦл, дНТП, прајмери, шаблонска ДНК или ДНК полимераза. Međutim, pogrešna koncentracija takvih reagenasa može dovesti do lažnih rezultata, smanjujući strogost reakcije. Prilikom rešavanja problema sa PCR-om, istovremeno treba manipulisati samo jednim reagensom. Međutim, možda bi bilo pametno titrirati manipulisani reagens.

Магнезијумова со Мг 2+ (крајња реакциона концентрација од 0,5 до 5,0 мМ) Термостабилне ДНК полимеразе захтевају присуство магнезијума да делује као кофактор током процеса реакције. Промена концентрације магнезијума један је од најједноставнијих реагенса за манипулацију са можда највећим утицајем на строгост ПЦР -а. Generalno, prinos PCR proizvoda će se povećati sa dodatkom većih koncentracija Mg 2+. Међутим, повећане концентрације Мг 2+ такође ће смањити специфичност и верност ДНК полимеразе. Većina proizvođača uključuje rastvor magnezijum hlorida (MgCl2) zajedno sa DNK polimerazom i 10X PCR puferskim rastvorom. 10 X PCR puferski rastvori mogu da sadrže 15 mM MgCl2, što je dovoljno za tipičnu PCR reakciju, ili se može dodati odvojeno u koncentraciji optimizovanoj za određenu reakciju. Мг 2+ се заправо не троши у реакцији, али реакција не може да се настави без њеног присуства. Када има превише Мг 2+, то може спречити потпуну денатурацију шаблона ДНК стабилизацијом дуплекс ланца. Previše Mg 2+ takođe može da stabilizuje lažno žarenje prajmera na netačna mesta šablona i da smanji specifičnost što rezultira neželjenim PCR proizvodima. Када нема довољно Мг 2+, реакција се неће наставити, па неће доћи до ПЦР продукта.

Калијумова со К + (крајња реакциона концентрација од 35 до 100 мМ) Дужи ПЦР производи (10 до 40 кб) имају користи од смањења калијумове соли (КЦл) од њене нормалне концентрације реакције од 50 мМ, често заједно са додатком ДМСО и/или глицерол. Ako je željeni amplikon ispod 1000 bp i formiraju se dugi nespecifični proizvodi, specifičnost se može poboljšati titriranjem KCl, povećavajući koncentraciju u koracima od 10 mM do 100 mM. Povećanje koncentracije soli omogućava kraćim molekulima DNK da denaturiraju prvenstveno u odnosu na duže molekule DNK.

Деоксинуклеотид 5'-трифосфати (коначна реакциона концентрација од 20 и 200 &#к003бцМ сваки) Деоксинуклеотид 5'-трифосфати (дНТП) могу изазвати проблеме за ПЦР ако нису у одговарајућим еквивалентним концентрацијама (тј. [А] = [Т] = [C] = [G]) i/ili zbog njihove nestabilnosti usled ponovnog zamrzavanja i odmrzavanja. Уобичајена концентрација дНТП -а је 50 &#к003бцМ СВАКОГ од четири дНТП -а. Međutim, PCR može tolerisati koncentracije između 20 i 200 μM svaka. Niže koncentracije dNTP-a mogu povećati i specifičnost i vernost reakcije, dok prekomerne koncentracije dNTP mogu zapravo inhibirati PCR. Међутим, за дуже ПЦР-фрагменте може бити потребна већа концентрација дНТП. Velika promena u koncentraciji dNTP može zahtevati odgovarajuću promenu koncentracije Mg 2+.

Termalno stabilne DNK polimeraze PCR enzimi i puferi povezani sa tim enzimima prešli su dug put od prvobitnih Так Прво је коришћена ДНК полимераза. Према томе, одабир одговарајућег ензима може бити од помоћи за добијање жељених ампликонских производа. Na primer, upotreba Так DNK polimeraza može biti poželjnija u odnosu na Pfu DNK polimerazu ako se želi procesnost i/ili dodavanje adenin ostatka na 3' krajeve PCR proizvoda. Додавање 3 'аденина постало је корисна стратегија за клонирање ПЦР производа у ТА векторе са 3' тиминским препустима. Међутим, ако је верност важнија, ензим као што је Пфу може бити бољи избор. Неколико произвођача има низ специфичних ДНК полимераза дизајнираних за посебне потребе. Pogledajte uslove reakcije i karakteristike željenog amplikona, a zatim uparite PCR eksperiment sa odgovarajućom DNK polimerazom. Većina proizvođača ima tabele koje pomažu pri odabiru DNK polimeraze navodeći karakteristike kao što su vernost, prinos, brzina, optimalne ciljne dužine i da li je to korisno za G-C bogatu amplfikaciju ili PCR sa vrućim startom.

Kvalitet i čistoća DNK šablona će imati značajan uticaj na verovatnoću uspešnog PCR eksperimenta. Концентрације ДНК и РНК могу се одредити помоћу њихових мерења оптичке густине на 260 нм (ОД260). Маса пречишћених нуклеинских киселина у раствору се израчунава на 50 &#к003бцг/мл дволанчане ДНК или 40 &#к003бцг/мл за РНК или једноланчану ДНК на ОД260 =1.0. Загађивачи екстракције ДНК су уобичајени инхибитори у ПЦР -у и треба их пажљиво избегавати. Uobičajeni inhibitori ekstrakcije DNK PCR-a uključuju proteine, RNK, organske rastvarače i deterdžente. Korišćenje maksimalne apsorpcije nukleinskih kiselina OD260 u poređenju sa proteinima OD280 (OD260/280), moguće je odrediti procenu čistoće ekstrahovane DNK. У идеалном случају, однос ОД260/280 је између 1,8 и 2,0. Lower OD260/280 је индикатор контаминације протеинима и/ или растварачима који ће, по свој прилици, бити проблематичан за ПЦР. Осим квалитета ДНК шаблона, оптимизација количине ДНК може увелико користити исходу ПЦР експеримента. Иако је згодно одредити количину у нг/&#к003бцл, што је често излаз за савремене наноспектрофотометре, релевантна јединица за успешан ПЦР експеримент је број молекула. To jest, koliko kopija DNK šablona sadrži sekvencu komplementarnu PCR prajmerima? Optimalni ciljni molekuli su između 10 4 do 10 7 molekula i mogu se izračunati kao što je opisano u gornjim napomenama.

9. Адитивни реагенси

Dodatni reagensi mogu dati rezultate kada sve drugo ne uspe. Разумевање реагенса и за шта се они користе критично је у одређивању који реагенси могу бити најефикаснији у стицању жељеног ПЦР производа. Dodavanje reagenasa u reakciju je komplikovano činjenicom da manipulacija jednim reagensom može uticati na upotrebljivu koncentraciju drugog reagensa. Pored dole navedenih reagenasa, od mnogih biotehnoloških kompanija dostupni su vlasnički komercijalno dostupni aditivi.

10. Адитиви који погодују богатим шаблонима Г-Ц

Dimetilsulfoksid (konačna reakciona koncentracija od 1-10% DMSO) U PCR eksperimentima u kojima je šablon DNK posebno bogat G-C (sadržaj GC 㹠%), dodavanje DMSO može poboljšati reakciju ometanjem uparivanja baza i efektivnim smanjenjem Tм. Neki Tм калкулатори укључују променљиви унос за додавање жељене концентрације ДМСО у ПЦР експерименту. Међутим, додавање више од 2% ДМСО -а може захтевати додавање још ДНК полимеразе јер се показало да инхибира Так DNK polimeraza.

Formamid (konačna reakciona koncentracija od 1,25-10%) Kao i DMSO, formamid takođe remeti uparivanje baza dok povećava strogost prajmerskog žarenja, što rezultira manje nespecifičnim prajmerom i povećanom efikasnošću amplifikacije. Formamid se takođe pokazao kao pojačivač za šablone bogate G-C.

7-деаза-2'-деоксигуанозин 5'-трифосфат (коначна концентрација реакције дц 7 ГТП 3 дц 7 ГТП: 1 дГТП 50 &#к003бцМ) Користећи 3 дела, или 37,5 &#к003бцМ, аналога базе гванозина дц 7 ГТП заједно са 1 делом, или 12,5 &#к003бцМ, дГТП ће дестабилизовати стварање секундарних структура у производу. Како се ампликонска или шаблона ДНК денатурише, често ће формирати секундарне структуре, попут петљи за укоснице. Ugradnja dc 7 GTP u DNK amplikon će zabraniti formiranje ovih aberantnih struktura.

dc 7 GTP slabi signal bojenja etidijum bromidom zbog čega se koristi u odnosu 3:1 sa dGTP.

Betain (konačna reakciona koncentracija od 0,5M do 2,5M) Betain (N,N,N-trimetilglicin) je analog cviterjonske amino kiseline koji smanjuje i čak može eliminisati zavisnost temperature topljenja DNK od sastava nukleotida. Користи се као додатак за помоћ ПЦР амплификацији мета богатих Г-Ц. Бетаин се често користи у комбинацији са ДМСО и може увелико повећати шансе за појачавање циљне ДНК са високим садржајем Г-Ц.

11. Aditivi koji pomažu PCR-u u prisustvu inhibitora

Нејонски детерџенти делују тако да потискују стварање секундарне структуре и помажу у стабилизацији ДНК полимеразе. Nejonski deterdženti kao što su Triton X-100, Tween 20 ili NP-40 mogu se koristiti u reakcionim koncentracijama od 0,1 do 1% da bi se povećala proizvodnja amplikona. Međutim, koncentracije iznad 1% mogu inhibirati PCR. Prisustvo nejonskih deterdženata smanjuje strogost PCR-a, što potencijalno dovodi do stvaranja lažnog proizvoda. Međutim, njihova upotreba će takođe neutralisati inhibitorne efekte SDS-a, povremenog zagađivača protokola za ekstrakciju DNK.

Додавање специфичних протеина као што је говеђи серумски албумин (БСА) који се користи при 400 нг/&#к003бцл и/или Т4 гена 32 протеина при 150 нг/&#к003бцл помаже ПЦР у присуству инхибитора као што је ФеЦл3, хемин, фулвична киселина, хуминска киселина, танинске киселине или екстракти из измета, слатке воде и морске воде. Međutim, neki PCR inhibitori, uključujući žučne soli, bilirubin, EDTA, NaCl, SDS ili Triton X-100, ne ublažavaju se dodavanjem proteina BSA ili T4 gena 32.

12. Измене бициклистичких услова

Оптимизација температуре жарења ће побољшати сваку ПЦР реакцију и треба је размотрити у комбинацији са другим адитивима и/ или заједно са другим модификацијама услова циклуса. Дакле, да би се израчунала оптимална температура жарења, користи се следећа једначина: Та OPT = 0,3 Tм Prajmer + 0,7 Tм Производ -14.9 Тм Prajmer se izračunava kao Tм мање стабилног пара помоћу једначине: Тм Primer = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273,15 + 16,6 log[K + ] Gde je ΔH zbir promena entalpije najbližeg suseda za hibride ΔS je zbir promena entropije najbližeg suseda R je gasna konstanta (1,99 cal K-1 mol-1) C je koncentracija prajmera i [K +] је концентрација калијума. Poslednja jednačina se može izračunati korišćenjem jednog od Tм kalkulatori navedeni na sledećoj veb stranici: http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html Tм Производ се израчунава на следећи начин: Т.м Производ = 0,41 (%Г -Ц) + 16,6 лог [К +] - 675/дужина производа Za većinu PCR reakcija koncentracija kalijuma ([K + ]) će biti 50 mM.

ПЦР са топлим покретањем је свестрана модификација у којој се почетно време денатурације драматично повећава (Табела 4). Ова модификација може бити уграђена са или без других модификација услова вожње. Štaviše, često se koristi u kombinaciji sa aditivima za formiranje temperamentnog amplikona. У ствари, ПЦР са врућим стартом се све више укључује као редован аспект општих услова бициклизма. Показало се да врући старт повећава принос ампликона, док повећава специфичност и верност реакције.Obrazloženje iza vrućeg starta PCR-a je da se eliminiše prajmer-dimer i nespecifično prajming koji može da nastane kao posledica postavljanja reakcije ispod Tм. Dakle, tipična reakcija vrućeg pokretanja zagreva uzorak na temperaturu iznad optimalne Tм, најмање на 60 &#к000б0Ц пре него што дође до било каквог појачања. Генерално, ДНК полимераза се задржава из реакције током почетног, продуженог, денатурисања. Иако се уместо ДНК полимеразе понекад изостављају друге компоненте реакције, овде ћемо се фокусирати на ДНК полимеразу. Postoji nekoliko metoda koje omogućavaju da DNK polimeraza ostane neaktivna ili fizički odvojena dok se ne završi početni period denaturacije, uključujući upotrebu čvrste barijere od voska, antitela protiv DNK polimeraze i pomoćnih proteina. Alternativno, DNK polimeraza se može jednostavno dodati u reakciju nakon što je početni ciklus denaturacije završen.

Touchdown PCR (TD-PCR) ima za cilj da izvuče neke od nagađanja iz Tм ograničenja proračuna stavljanjem u zagrade izračunatih temperatura žarenja. Koncept je da se dizajniraju dve faze biciklističkih uslova (Tabela 5). Prva faza koristi sukcesivno niže temperature žarenja svakog drugog ciklusa (tradicionalno 1,0 ଌ), počevši od 10 ଌ iznad i završavajući na izračunatom Tм или мало испод. Друга фаза користи стандардне услове у 3 корака са температуром жарења постављеном на 5 &#к000б0Ц испод израчунатог Тм za još 20 do 25 ciklusa. Funkcija prve faze treba da ublaži pogrešno prajmerisanje, dajući 4 puta prednost ispravnom proizvodu. Тако би, након 10 циклуса, предност од 410 пута дала 4096 примерака исправног производа у односу на било које лажно лакирање.

Stepdown PCR je sličan TD-PCR sa manje inkremenata u prvoj fazi prajminga. На пример, прва фаза снижава температуре жарења сваког другог циклуса за 3 &#к000б0Ц, почевши од 10 &#к000б0Ц изнад и завршавајући на 2 &#к000б0Ц испод израчунатог Тм. Као и ТД-ПЦР, друга фаза користи стандардне услове у 3 корака са температуром жарења постављеном на 5 &#к000б0Ц испод израчунатог Тм za još 20 do 25 ciklusa. Ово би омогућило исправном производу 256 пута предност у односу на производе са лажним пуњењем.

Slowdown PCR je jednostavno modifikacija TD-PCR-a i bila je uspešna u pojačavanju sekvenci izuzetno bogatih G-C (iznad 83%) (Tabela 6). Koncept uzima u obzir relativno novu karakteristiku povezanu sa modernim termalnim ciklusima, koja omogućava podešavanje brzine rampe kao i brzine hlađenja. Protokol takođe koristi dc 7 GTP da smanji formiranje 2 ° strukture koja bi mogla da inhibira reakciju. Брзина рампе је смањена на 2,5 &#к000б0Ц с -1 са брзином хлађења од 1,5 &#к000б0Ц с -1 за циклусе жарења. Прва фаза почиње са температуром жарења од 70 &#к000б0Ц и смањује температуру жарења за 1 &#к000б0Ц свака 3 круга док не достигне 58 &#к000б0Ц. Druga faza se zatim nastavlja sa temperaturom žarenja od 58 ଌ za dodatnih 15 ciklusa.

Угнијежђена ПЦР моћно је средство за уклањање лажних производа. Употреба угнежђених прајмера је посебно корисна када постоји неколико паралогних гена у једном геному или када постоји мали број копија циљне секвенце унутар хетерогене популације ортологних секвенци. Основни поступак укључује два сета прајмера који појачавају један регион ДНК. Спољни прајмери ​​заузимају сегмент од интереса и користе се за генерисање ПЦР производа који су често неспецифични у 20 до 30 циклуса. Мали аликвот, обично око 5 &#к003бцл од првих 50 &#к003бцл реакција, затим се користи као ДНК шаблона за још 20 до 30 кругова амплификације користећи други скуп прајмера који се жаре на унутрашњој локацији у односу на први комплет.

Drugi PCR protokoli su specijalizovaniji i prevazilaze okvire ovog rada. Primeri uključuju RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR i RT-PCR.

13. Reprezentativni rezultati

Reprezentativni PCR rezultati su generisani praćenjem osnovnih PCR protokola opisanih iznad. Резултати укључују неколико стратегија решавања проблема како би се показао ефекат различитих реагенса и услова на реакцију. Гени из квасца који расте Саццхаромицес церевисиае и из некарактеристичног микобактериофага појачани су у овим експериментима. Standardni PCR protokol u 3 koraka naveden u Tabeli 2 je korišćen za sva tri eksperimenta opisana u nastavku.

Пре постављања ПЦР експеримента, геномска ДНК из оба С. церевисиае i mikobakteriofag su kvantifikovani i razblaženi do koncentracije koja bi omogućila između 104 i 107 molekula DNK po reakciji. Радне залихе су припремљене на следећи начин. Геномски препарат ДНК квасца дао је 104 нг/&#к003бцл. Razblaživanje do 10 ng/μl je generisano dodavanjem 48 μl u 452 μl TE pH 8.0 pufera. Pošto je С. церевисиае genom je oko 12,5 Mb, 10 ng sadrži 7,41 X 10 5 molekula. Preparat genomske DNK mikobakteriofaga dao je 313 ng/μl. Разблаживање до 2 нг/&#к003бцл генерисано је додавањем 6.4 &#к003бцл у 993.6 &#к003бцл пуфера ТЕ пХ 8.0. ДНК овог фага је око 67 Кб. Dakle, 1 ng sadrži 2,73 X 10 7 molekula, što je na gornjoj granici DNK koja se generalno koristi za PCR. Radne zalihe su zatim korišćene za generisanje Master Mix rešenja navedenih u Табела 7. Eksperimenti su menjali uslove biciklizma kao što je opisano u nastavku.

In Slika 3a, геномска ДНК из С. церевисиае je korišćen kao šablon za amplifikaciju GAL3 gena, koji kodira protein uključen u metabolizam galaktoze. Cilj ovog eksperimenta je bio da se odredi optimalna koncentracija Mg 2+ za ovaj set reagenasa. Nema MgCl2 био присутан у оригиналном ПЦР пуферу и морао је бити допуњен у назначеним концентрацијама са опсегом тестираним од 0,0 мМ до 5,0 мМ. Као што је приказано на слици, ПЦР производ очекиване величине (2098 бп) појављује се почевши од концентрације Мг 2+ од 2,5 мМ (трака 6) са оптималном концентрацијом од 4,0 мМ (трака 9). Препоручена концентрација коју је обезбедио произвођач била је 1,5 мМ, што је количина наведена у типичним пуферима за ПЦР. Možda iznenađujuće, neophodna koncentracija potrebna za formiranje proizvoda u ovom eksperimentu premašila je ovu količinu.

Za eksperiment predstavljen u korišćen je drugačiji DNK šablon Слика 3б. Genomska DNK iz mikobakteriofaga je korišćena za amplifikaciju očuvanog segmenta DNK od 566 bp. Kao i prethodni eksperiment, trebalo je odrediti optimalnu koncentraciju Mg 2+. Као што је приказано у Слика 3б, amplifikacija željenog PCR proizvoda zahteva najmanje 2,0 mM Mg 2+ (traka 5). Dok je bilo više varijabilnosti u količini proizvoda formiranog pri rastućim koncentracijama MgCl2, najviše PCR proizvoda je primećeno na 4 mM Mg 2+ (traka 9), ista koncentracija primećena za GAL3 gen kvasca.

Primetite da u eksperimentima predstavljenim u Slike 3A i 3B, дискретна трака је добијена коришћењем услова циклуса за које се сматра да су оптимални на основу температура жарења прајмера. Konkretno, temperatura denaturacije je bila 95 °C sa temperaturom žarenja od 61 °C, a produženje je izvedeno 1 minut na 72 °C tokom 30 ciklusa. Poslednje produženje od 5 minuta je zatim urađeno na 72 ଌ. Za treći eksperiment predstavljen u Слика 3ц, izvršene su tri promene u uslovima ciklusa koji se koriste za amplifikaciju GAL3 gena kvasca. Prvo, temperatura žarenja je smanjena na podoptimalnu temperaturu od 58 ଌ. Drugo, vreme produženja je produženo na 1 minut i 30 sekundi. Treće, broj ciklusa je povećan sa 30 na 35 puta. Сврха је била показати ефекте суб-оптималних услова амплификације (тј. Смањење строгости реакције) на ПЦР експерименту. Као што је приказано у Слика 3ц, u čemu je bio diskretni bend Slika 3a, постаје мрља неспецифичних производа у овим подоптималним условима вожње. Штавише, са смањењем укупне строгости реакције, потребна је мања количина Мг 2+ за формирање ампликона.

Сва три експеримента показују да када су концентрације Мг 2+ прениске, нема производње ампликона. Ови резултати такође показују да када су услови циклуса правилно дизајнирани и да су реагенси у оптималним концентрацијама, ПЦР експеримент производи дискретан ампликон који одговара очекиваној величини. Rezultati pokazuju važnost izvođenja PCR eksperimenata sa dovoljno visokom strogošću (npr. diskretne trake u odnosu na razmaz). Štaviše, eksperimenti pokazuju da promena jednog parametra može uticati na drugi parametar, što utiče na ishod reakcije.

Табела 1. PCR reagensi redosledom kojim treba da se dodaju.

*Јединице се могу разликовати међу произвођачима

** Додајте све реагенсе у Мастер Мик искључујући све којима је потребна титрација или који могу бити променљиви у односу на реакцију. Glavna mešavina prikazana u gornjoj tabeli je izračunata za 11 reakcija plus 2 dodatne reakcije da bi se prilagodio gubitak pri prenosu pipetom, obezbeđujući da ima dovoljno za alikvot za svaku reakcionu epruvetu.

 Standardni PCR ciklus u 3 koraka 
Korak ciklusaTemperaturaвремеБрој циклуса
Inicijalna denaturacija94 &#к000б0Ц до 98 &#к000б0Ц1 минут1
Денатурација Жарење Ектенсион94 &#к000б0Ц 5 &#к000б0Ц испод Тм 70 ଌ do 80 ଌ 10 до 60 секунди 30 секунди Амплицон и ДНА полимераза зависни 25-35
Final Extension70 ଌ do 80 ଌ5 минута1
Држати*4 ଌ1

Tabela 2. Standardni PCR ciklus u 3 koraka.

* Већина термалних циклуса има могућност паузе на 4 &#к000б0Ц на неодређено време на крају циклуса.

 ПЦР бициклизам у 2 корака 
Korak ciklusaTemperaturaвремеБрој циклуса
Inicijalna denaturacija94 &#к000б0Ц до 98 &#к000б0Ц1 минут1
Денатурација Жарење/Продужење94 &#к000б0Ц 70 &#к000б0Ц до 80 &#к000б0Ц10 до 60 секунди Амплицон и ДНА полимераза зависни 25-35
Final Extension70 ଌ do 80 ଌ5 минута1

Tabela 3. PCR ciklus u 2 koraka.

 Hot Start PCR Cycling&#к000а0
Korak ciklusaTemperaturaвремеЦиклуси
Inicijalna denaturacija60 &#к000б0Ц до 95 &#к000б0Ц5 минута, затим додајте ДНК полимеразу1
Денатурација Жарење Ектенсион94 &#к000б0Ц 5 &#к000б0Ц испод Тм 70 ଌ do 80 ଌ10 до 60 секунди 30 секунди Амплицон и ДНА полимераза зависни 25-35
Final Extension70 ଌ do 80 ଌ5 минута1

Tabela 4. Хот Старт ПЦР Бициклизам.

&#к000а0Touchdown PCR biciklizam&#к000а0
Korak ciklusaTemperaturaвремеЦиклуси
Inicijalna denaturacija94 &#к000б0Ц до 98 &#к000б0Ц1 минут1
Денатурација Жарење Ектенсион94 &#к000б0Ц Кс = 10 &#к000б0Ц изнад Т.м 70 ଌ do 80 ଌ10 до 60 секунди 30 секунди Амплицон и ДНА полимераза зависни 2
Денатурација Жарење Ектенсион94 ଌ X-1 ଌ smanjiti 1 ଌ svaki drugi ciklus 70 ଌ na 80 ଌ10 do 60 sekundi 30 sekundi Zavisno od amplikona i polimeraze 28
Денатурација Жарење Ектенсион94 &#к000б0Ц 5 &#к000б0Ц испод Тм 70 ଌ do 80 ଌ10 до 60 секунди 30 секунди Амплицон и ДНА полимераза зависни 20-25
Final Extension70 ଌ do 80 ଌ5 минута1

Табела 5. Тоуцхдовн ПЦР Бициклизам.

 Slowdown PCR Cycling&#к000а0
Korak ciklusaTemperaturaвремеЦиклуси
Inicijalna denaturacija94 &#к000б0Ц до 98 &#к000б0Ц1 минут1
Денатурација Жарење Ектенсион94 ଌ X ଌ =10 ଌ iznad Tм 70 ଌ do 80 ଌ10 do 60 sekundi 30 sekundi Zavisno od amplikona i polimeraze 2
Денатурација Жарење Ектенсион94 ଌ X-1 ଌ smanjiti 1 ଌ svaki drugi ciklus 70 ଌ na 80 ଌ*10 do 60 sekundi 30 sekundi Zavisno od amplikona i polimeraze 28
Денатурација Жарење Ектенсион94 &#к000б0Ц 5 &#к000б0Ц испод Тм 70 ଌ do 80 ଌ10 do 60 sekundi 30 sekundi Zavisno od amplikona i polimeraze 20-25
Final Extension70 ଌ do 80 ଌ5 минута1

Tabela 6. Успори ПЦР бициклизам.

*Za PCR usporavanja, brzina rampe je smanjena na 2,5 ଌ s -1 sa brzinom hlađenja od 1,5 ଌ s -1 za cikluse žarenja.

Табела 7. Titracija Mg 2+ koja se koristi u Слика 3.

Слика 1. Uobičajeni problemi koji se javljaju kod prajmera i PCR amplifikacije ciljne DNK u 3 koraka. (a) Samo-žarenje prajmera koje rezultira formiranjem sekundarne strukture petlje ukosnice. Imajte na umu da se prajmeri ne žare uvek na krajnjim krajevima i mogu formirati manje strukture petlje. (б) Прајмер међусобно жарење, уместо ДНК шаблона, стварајући димер прајмера. Jednom kada se prajmeri zakare jedan sa drugim, oni će se izdužiti do krajeva prajmera. (c) PCR ciklusi koji generišu specifičan amplikon. Standardni PCR ciklus u 3 koraka uključuje denaturaciju DNK šablona, ​​žarenje prajmera i proširenje ciljne DNK (amplikona) pomoću DNK polimeraze.

Slika 2. Канта за лед са реагенсима, пипетама и сталцима потребна за ПЦР. (1.) pipeta P-200, (2.) pipeta P-1000, (3.) pipeta P-20, (4.) pipeta P-10, (5.) ploča sa 96 bunarčića i PCR epruvete od 0,2 ml tankih zidova , (6.) Reagensi uključujući Так polimeraza, 10X PCR pufer, MgCl2, sterilna voda, dNTP, prajmeri i šablon DNK, (7.) epruvete od 1,8 ml i stalak.

Слика 3. Пример титрације Мг 2+ који се користи за оптимизацију ПЦР експеримента коришћењем стандардног ПЦР протокола у 3 корака. (а) С. церевисиае Геномска ДНК квасца је коришћена као шаблон за амплификацију 2098 бп ГАЛ3 гена. U stazama 1 - 6, gde je koncentracija Mg 2+ preniska, ili nema formiranog proizvoda (trake 1-5) ili se formira veoma malo proizvoda (traka 6). Trake 7 - 11 predstavljaju optimalne koncentracije Mg 2+ za ovaj PCR eksperiment na šta ukazuje prisustvo amplikonskog proizvoda od 2098 bp. (б) Некарактеристичан шаблон геномске ДНК микобактериофага коришћен је за амплификацију ампликона од 566 бп. Траке 1 - 4, концентрација Мг 2+ је прениска, на шта указује одсуство производа. Траке 5 - 11 представљају оптималне концентрације Мг 2+ за ову ПЦР, на шта указује присуство ампликонског производа од 566 кб. (ц). С. церевисиае Genomska DNK kvasca je korišćena kao šablon za amplifikaciju GAL3 gena od 2098 bp kao što je naznačeno na panelu a. Međutim, temperatura žarenja je smanjena sa 61 ଌ na 58 ଌ, što je rezultiralo nespecifičnim PCR trakama promenljive dužine koje su proizvele efekat razmazivanja na agaroznom gelu. Trake 1 - 4, gde je koncentracija Mg 2+ preniska, ne dolazi do formiranja proizvoda. Траке 5 - 8 представљају оптималне концентрације Мг 2+ за ову ПЦР, што се види по присуству размаза и траке око величине ампликона 2098 кб. Траке 9 - 11 указују на престроге услове без стварања производа. (a-c) Trake 12 su negativna kontrola koja nije sadržala nikakav šablon DNK. Traka M (marker) je bila napunjena merdevinama NEB 1kb.

Slika 4. Sterilne epruvete koje se koriste za PCR. (1.) Епрувета од 1,8 мл (2.) 0,2 мл појединачна ПЦР епрувета са танким зидовима, (3) ПЦР епрувете и поклопци са танким зидовима од 0,2 мл.

Slika 5. Termalni ciklus. Затворена слика термичког циклуса лево. Desna slika sadrži PCR epruvete sa tankim zidovima od 0,2 ml postavljene u grejni blok otvorenog termalnog ciklusa.


Т5-ЛИКЕ ПХАГЕС (СИПХОВИРИДАЕ)

Клонирање гена из Т5 или БФ23

Mnogi restrikcijski fragmenti iz T5 ili BF23 DNK se ne mogu direktno klonirati jer oni ili kodiraju smrtonosne proizvode ili sadrže tako jake promotere da ćelije koje ih sadrže ne mogu da prežive. Снага неких промотора Т5 потакнула је њихову употребу у експресијским векторима, од којих су неки комерцијално доступни. Fragmenti koji su klonirani su uglavnom iz regiona od 58 do 92%, što uključuje uglavnom kasne strukturne gene sa nekim ranim genima, i od 21 do 36%, što uključuje sve tRNK gene koji se eksprimiraju tokom ranog perioda. Клониран је и мали фрагмент од 2,1 до 3,4% у предраном региону.

Т5 гени који су прекомерно произведени из вектора експресије укључују ген D7-8-9 (кодирање Т5 ДНК полимеразе), ген Д15 (кодирање за Т5 5′-егзонуклеазу), и 11п (кодирање липопротеина који инактивира рецепторе ћелија домаћина). БФ23 гени 24 и 25 (кодирају мањи и главни репни протеин) су такође клонирани, секвенцирани и експримирани.


Osnovne tehnike za manipulaciju genetskim materijalom (DNK i RNK)

Да бисте разумели основне технике које се користе за рад са нуклеинским киселинама, запамтите да су нуклеинске киселине макромолекуле направљене од нуклеотида (шећера, фосфата и азотне базе) повезане фосфодиестерским везама. Svaka fosfatna grupa na ovim molekulima ima neto negativno naelektrisanje. Читав скуп молекула ДНК у језгру назива се геном. ДНК има два комплементарна ланца повезана водоничним везама између упарених база. Izlaganje visokim temperaturama (denaturacija DNK) može razdvojiti dva lanca i hlađenje ih može ponovo odžariti. Enzim DNK polimeraza može replicirati DNK. За разлику од ДНК, која се налази у језгру еукариотских ћелија ’, молекули РНК напуштају језгро. Најчешћи тип РНК који истраживачи анализирају је мессенгер РНА (мРНА) јер представља гене који кодирају протеине који се активно експримирају. Međutim, molekuli RNK predstavljaju neke druge izazove za analizu, jer su često manje stabilni od DNK.

Екстракција ДНК и РНК

За проучавање или манипулацију нуклеинским киселинама, потребно је прво изоловати или екстраховати ДНК или РНК из ћелија. Istraživači koriste različite tehnike za ekstrakciju različitih tipova DNK (slika 2). Већина техника екстракције нуклеинских киселина укључује кораке за отварање ћелије и употребу ензимских реакција за уништавање свих непожељних макромолекула (као што је нежељена разградња молекула и одвајање од узорка ДНК). Пуфер за лизу (раствор који је углавном детерџент) разбија ћелије. Имајте на уму да лиза значи “дељење ”. Ovi enzimi razbijaju lipidne molekule u ćelijskim membranama i nuklearnim membranama. Ензими попут протеаза који разграђују протеине инактивирају макромолекуле и рибонуклеазе (РНК) које разграђују РНК. Употреба алкохола таложи ДНК. Људска геномска ДНК је обично видљива као желатинозна, бела маса. Uzorci DNK se mogu čuvati zamrznuti na –80°C nekoliko godina.

Слика 2: Овај дијаграм приказује основни метод екстракције ДНК.

Naučnici vrše analizu RNK da bi proučavali obrasce ekspresije gena u ćelijama. RNK je prirodno veoma nestabilna jer su RNK-aze obično prisutne u prirodi i veoma ih je teško inaktivirati. Slično DNK, ekstrakcija RNK uključuje korišćenje različitih pufera i enzima za inaktivaciju makromolekula i očuvanje RNK.

Гел електрофореза

Пошто су нуклеинске киселине негативно наелектрисани јони при неутралном или базном пХ у воденом окружењу, електрично поље их може мобилисати. Електрофореза у гелу је техника коју научници користе за одвајање молекула на основу величине, користећи овај набој. Nukleinske kiseline se mogu odvojiti kao celi hromozomi ili fragmenti. Nukleinske kiseline se učitavaju u otvor blizu negativne elektrode polučvrste, porozne matrice gela i povlače se prema pozitivnoj elektrodi na suprotnom kraju gela. Мањи молекули се крећу кроз поре гела брже од већих молекула. Ova razlika u stopi migracije razdvaja fragmente na osnovu veličine. Postoje standardni uzorci molekularne težine koje istraživači mogu pokrenuti pored molekula kako bi obezbedili poređenje veličine. Можемо посматрати нуклеинске киселине у гел матрици користећи различите флуоресцентне или обојене боје. Различити фрагменти нуклеинске киселине појављују се као траке на одређеним удаљеностима од врха гела (крај негативне електроде) на основу њихове величине (слика 3). Смеша геномских фрагмената ДНК различитих величина појављује се као дугачак размаз, док је несечена геномска ДНК обично превелика да би прошла кроз гел и формира једну велику траку на врху гела.

Slika 3: а) Приказани су фрагменти ДНК из седам узорака који су покренути на гелу, обојени флуоресцентном бојом и прегледани под УВ светлом и б) истраживач са Међународног истраживачког института за пиринач, прегледавајући профиле ДНК користећи УВ светлост. (kredit: a: James Jacob, Tompkins Cortland Community College b: Međunarodni institut za istraživanje riže)

Појачавање фрагмената нуклеинске киселине ланчаном реакцијом полимеразе

Иако је геномска ДНК видљива голим оком при масовној екстракцији, ДНК анализа често захтијева фокусирање на једну или више специфичних регија генома. Полимеразе Ланчана реакција (ПЦР) је техника коју научници користе за појачавање специфичних региона ДНК за даљу анализу (слика 4). Istraživači koriste PCR za mnoge svrhe u laboratorijama, kao što je kloniranje fragmenata gena za analizu genetskih bolesti, identifikaciju kontaminantne strane DNK u uzorku i amplifikaciju DNK za sekvenciranje. Praktične primene uključuju utvrđivanje očinstva i otkrivanje genetskih bolesti.

Слика 4: Научници користе ланчану реакцију полимеразе или ПЦР за појачавање одређене секвенце ДНК. Прајмери ​​- кратки делови ДНК комплементарни сваком крају циљне секвенце комбинују се са геномском ДНК, Так полимеразом и деоксинуклеотидима. Так полимераза је ДНК полимераза изолована из термостабилне бактерије Тхермус акуатицус који је у стању да издржи високе температуре које научници користе у ПЦР -у. Тхермус акуатицус raste u basenu Donjeg gejzira Nacionalnog parka Jelouston. PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR) je sličan PCR-u, ali cDNK se pravi od RNK šablona pre nego što PCR počne.

DNK fragmenti se takođe mogu amplificirati iz RNK šablona u procesu koji se naziva PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR). Први корак је поновно стварање оригиналног ланца шаблона ДНК (који се назива цДНК) применом ДНК нуклеотида на мРНК. Овај процес се назива реверзна транскрипција. Ово захтева присуство ензима који се назива реверзна транскриптаза. Након што се направи цДНК, може се користити редовна ПЦР да би се појачала.


DNK manipulacija

Bsu ДНК полимераза И, велики фрагмент задржава 5´ → 3´ полимеразну активност Бациллус субтилис ДНК полимераза И (1), али јој недостаје домен егзонуклеазе 5´ → 3´. Ovom velikom fragmentu prirodno nedostaje aktivnost 3´→ 5´ egzonukleaze.

DNK polimeraza I (E. coli) (НЕБ #М0209)

ДНК полимераза И (E. coli) је ДНК-зависна ДНК полимераза са инхерентним 3´ → 5´ и 5´ → 3´ егзонуклеазним активностима (2). Aktivnost egzonukleaze 5´→ 3´ uklanja nukleotide ispred rastućeg lanca DNK, omogućavajući nick-translaciju.

DNK polimeraza I, veliki (Klenow) fragment (NEB #M0210)

ДНК полимераза И, велики (Кленов) фрагмент је протеолитички производ E. coli ДНК полимераза И, која задржава полимеризацију и 3 '→ 5' егзонуклеазну активност, али је изгубила 5 '→ 3' егзонуклеазну активност (3). Klenow zadržava vernost polimerizacije holoenzima bez degradacije 5' završetaka.

Кленов фрагмент (3´ → 5´ егзо-) (НЕБ #М0212)

Кленов фрагмент (3´ → 5´ егзо-) је Н-терминално крње ДНК полимеразе И, које задржава полимеразну активност, али је изгубило 5´ → 3´ егзонуклеазну активност и има мутације (Д355А, Е357А), које укидају 3´ → 5´ активност егзонуклеазе (4).

Phi29 DNK polimeraza (NEB #M0269)

пхи29 ДНА полимераза је репликативна полимераза из Бациллус субтилис fag, phi29 (Φ29) (5). Ova polimeraza ima izuzetna svojstva pomeranja niti i procesne sinteze (6). Полимераза има својствену 3´ → 5´ лекторску активност егзонуклеазе (7).

T4 DNK polimeraza (NEB #M0203)

Т4 ДНК полимераза катализује синтезу ДНК у смеру 5´ → 3´ и захтева присуство шаблона и прајмера. Овај ензим има 3´ → 5´ егзонуклеазну активност, која је много активнија од оне која се налази у ДНК полимерази И. За разлику од E. coli DNK polimeraza I, T4 DNK polimeraza nema funkciju 5´→ 3´ egzonukleaze.

Т7 ДНК полимераза (немодификована) (НЕБ #М0274)

Т7 ДНК полимераза (немодификована) катализује репликацију ДНК Т7 фага током инфекције. Proteinski dimer ima dve katalitičke aktivnosti: aktivnost DNK polimeraze i jaku aktivnost 3´→ 5´ egzonukleaze (8,9,10). Visoka vernost i brza stopa proširenja enzima čine ga posebno korisnim u kopiranju dugih delova DNK šablona.

Терминална трансфераза (НЕБ #М0315)

Terminalna transferaza (TdT) je polimeraza nezavisna od šablona koja katalizuje dodavanje deoksinukleotida na 3' hidroksilni kraj molekula DNK. Dvostruki ili jednolančani DNK molekuli koji strše, udubljeni ili sa tupim krajevima služe kao supstrat za TdT. Ензим од 58,3 кДа нема 5 'или 3' егзонуклеазну активност. Додавање Цо 2+ у реакцији чини јаловину ефикаснијом.

Референце

  1. Okazaki, T. et al. (1964) Ј. Биол. Chem., 239, 259-268. ПМИД: 14114852
  2. Лехман, И.Р .. (1981) П.Д. Боиер (ур.), Ензими, 14А, стр. 16-38. Сан Диего: Ацадемиц Пресс.
  3. Јацобсен, Х., Кленов, Х. и Овергаард-Хансен, К. (1974) ЕУР. Ј. Биоцхем., 45, 623-7. ПМИД: 4605373
  4. Дербисхире, В. и сар. (1988) Наука, 240, 199-201. ПМИД: 1309614
  5. Бланцо, Л. и Салас, М. (1984) Proc. Натл. Акад. Сци. УСА, 81, 5325-9. PMID: 6433348
  6. Бланцо, Л. и сар. (1989) Ј. Биол. Chem., 264, 8935-40. PMID: 2498321
  7. Гармендиа, Ц., ет ал. (1992) Ј. Биол. Chem., 267, 2594-9. ПМИД: 1733957
  8. Хори, К. и сар. (1979) Ј. Биол. Chem., 258, 11598-11604. ПМИД: 227873
  9. Енглер, М. Ј. и сар. (1983) Ј. Биол. Chem., 258, 11165-73. ПМИД: 6411726
  10. Нордстром, Б. и сар. (1981) Ј. Биол. Chem., 256, 3112-7. PMID: 7009606

Izaberite tip:

Феатуре Артицлес

Прочитајте о односу између структуре и функције полимеразе при копирању ДНК.

  • Nasumično označavanje prajmera
  • Синтеза цДНА другог ланца
  • Синтеза ДНК са померањем нити (1)
  • Nick prevod DNK za dobijanje sondi sa visokom specifičnom aktivnošću (2)
  • ДНК секвенцирање по Сангер-овој дидеокси методи (3) • Попуњавање 5´ препуста за формирање тупих крајева (4) • Синтеза другог ланца у протоколима мутагенезе (5). • Uklanjanje prepusta od 3´ da bi se formirali tupi krajevi (4)
  • Субклонирање брисања једног ланца (6).
  • Додавање репова хомополимера на 3 'крајеве ДНК
  • Obeležavanje 3' krajeva DNK modifikovanim nukleotidima (npr. ddNTP, DIG-dUTP)
  • ТУНЕЛ тест (ин ситу локализација апоптозе)
  • ПЦР зависан од ТдТ

Овај производ је покривен једним или више патената, жигова и/или ауторских права у власништву или под контролом компаније Нев Енгланд Биолабс, Инц (НЕБ).

Док НЕБ развија и валидира своје производе за различите примене, употреба овог производа може захтевати од купца да прибави додатна права интелектуалне својине треће стране за одређене апликације.

За више информација о комерцијалним правима, молимо контактирајте НЕБ -ов тим за глобални пословни развој на гбд@неб.цом.

Овај производ је само за истраживачке сврхе. Ovaj proizvod nije namenjen za upotrebu u terapeutske ili dijagnostičke svrhe kod ljudi ili životinja.


Полимеразе Ланчана реакција

Lančana reakcija polimerazom je tehnika koja se koristi za proizvodnju više kopija fragmenata DNK. Proces amplifikacije DNK podeljen je u tri faze: фаза денатурисања, фаза жарења и фаза продужавања. У фази денатурисања, молекул ДНК се загрева до 95ºЦ да раздвоји два ланца. Прајмери ​​се затим причвршћују на сваки од нити у фази жарења. Фаза продужења затим наставља да додаје још нуклеотида у растући ланац. Кораци се понављају изнова како би се произвело више копија ДНК.


Подршка информације

S1 sl. BOMB magnetne perle.

(А) Честице магнетног језгра (видети С1 Додатак, БОМБ протокол 1.1) у ТЕМ -у. (Б) Магнетне перле превучене силицијум диоксидом (видети С1 Додатак, БОМБ протокол 2.1) у СЕМ и ТЕМ. (C) Magnetne perle obložene karboksilom (videti S1 Dodatak, BOMB protokol 3.1) u LM, sa i bez primenjenog magneta. БОМБ, Био-Он-Магнетиц-Беадс ЛМ, светлосна микроскопија СЕМ, скенирајућа електронска микроскопија ТЕМ, трансмисиона електронска микроскопија.

С2 Сл. Чишћење и искључивање ДНК по величини.

(А) Изузимање величине ГенеРулер ДНК лествичасте мешавине (Тхермо) помоћу магнетних зрна превучених силицијум диоксидом (видети С1 Додатак, БОМБ протокол 4.1). За постизање искључивања величине коришћене су различите запремине ББ у поређењу са запремином узорка, за поређење, коришћене су 2 запремине цББ или није укључен везивни пуфер (без ББ) (Б) Изузимање величине ГенеРулер ДНА Ладдер Мик помоћу карбоксилном превлаком magnetne perle (videti S1 Dodatak, BOMB protokol 4.2). За постизање искључења величине коришћене су различите запремине ББ у поређењу са запремином узорка. За поређење су коришћене 3 запремине цББ или нису укључене перле (без перлица). (C) Ukupan oporavak od približno 6 μg plazmidne DNK (ulaz) korišćenjem komercijalnog kompleta koji uključuje kolone upakovane silicijumom (komplet) ili S1 dodatak, BOMB protokol 4.1 za čišćenje perlicama obloženim silicijumom (BOMB). За везивање је коришћен цББ или ББ описан у горе наведеном БОМБ протоколу. Траке грешака представљају стандардну девијацију, н = 3. Osnovni podaci za S2 Fig mogu se naći u S2 podacima. ББ, пуфер за везивање БОМБ, био-на-магнетним куглицама цББ, комерцијални пуфер за везивање.

S3 Slika Optimizacija i kontrola kvaliteta BOMB protokola 5.1—ekstrakcija BOMB plazmida iz Е. цоли.

(А) Оптимизација запремине реакције и медијума. Једна колонија је убрана и употребљена за инокулацију предкултуре од 5 мл која садржи ЛБ подлогу и ампицилин. Kultura je inkubirana na 37 °C i 250 rpm dok se ne postigne OD od 0,6. 5 μl predkulture je korišćeno za inokulaciju različitih zapremina (0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml i 2,0 ml) različitih medija za rast ( LB, TB, SB, SOC i ZYM505, uključujući odgovarajući antibiotik) u ploči za kulturu od 2,2 ml sa 96 jažica (Sarstedt). Ploča je zatvorena poklopcem ploče za kulturu ćelija sa 6 jažica, tako da je bila moguća pristojna razmena vazduha, i inkubirana na 37 °C i 250 rpm tokom 22 sata. Затим је плазмидна ДНК изолована са С1 додатком, БОМБ протоколом 5.1, и добијена концентрација (ц [нг/μл]) је одређена. Траке грешака представљају стандардну девијацију, н = 3. (Б) Поређење комерцијално пречишћене плазмидне ДНК (комплет) и ДНК екстраховане БОМБ (БОМБ) са (+) и без ( -) рестрикције ензима рестрикције. МВ: ГенеРулер ДНА Ладдер Мик (Тхермо Сциентифиц). (C) Primer sekvenciranja plazmida ekstrahovanog BOMBom preko Sengerovog sekvenciranja. Обично се примећује дужина читања секвенцирања од најмање 800–1000 бп. Osnovni podaci za S3 Fig mogu se naći u S3 podacima. БОМБ, Био-Он-Магнетиц-Беадс ЛБ, Луриа-Бертани Бротх ТБ, Террифиц БротхСБ, Супер Бротх СОЦ, Супер Оптимал Бротх.

S4 Slika Izolacija genomske DNK iz različitih tkiva zeca.

Геномска ДНК је изолована из наведених ткива 12-часовног угинулог зеца, коришћењем С1 додатка, БОМБ протокола 6.3 и (А) Спеед Беадс или (Б) БОМБ силицијум диоксида. Такође је приказано поређење са (Ц) фенол-хлороформом екстракцијом. МВ у свим панелима представља Хиперладдер И (Биолине). Неизбежно, нека ткива (попут коштане сржи) производе далеко веће приносе (Д) по мг улазног материјала, у поређењу са другим ткивима. Међутим, методе засноване на зрнцима углавном надмашују екстракције фенола и хлороформа у нашим рукама. Напомена: зечја ткива нису сачувана одмах након смрти животиње, стога су ткива попут слезине доживела извесну деградацију ДНК. Osnovni podaci za S4 Fig mogu se naći u podacima S4. БОМБ, Био-Он-Магнетиц-Беадс.

S5 Slika Primer izolacije genomske DNK iz listova deteline (Trifolium repens).

Геномска ДНК је изолована из појединачних листова (приближно 5 мг ткива) применом С1 додатка, БОМБ протокол 6.4 (велика пропусност). Podskup DNK uzoraka (18) iz 96 ekstrakcija, predstavljenih na Slici 20, stavljen je na agarozni gel. МВ: Хипермехура И (Биолине). БОМБ, Био-Он-Магнетиц-Беадс.

S6 Slika Konverzija bisulfita.

(А) Шема анализе метилације ДНК применом конверзије бисулфита. (Б) Агарозни гел након ПЦР амплификације људске ДНК конвертоване бисулфитом. Успјешно је тестирано више парова прајмера са очекиваним величинама производа између 221 и 435 бп. МВ: ГенеРулер ДНА Ладдер Мик (Тхермо Сциентифиц). (Ц) Траг секвенцирања узорка конвертираног бисулфитом са ПЦР-ом, поравнат са оригиналном, неконвертованом секвенцом. Сви цитозини који нису ЦГ успешно су конвертовани. Стопа конверзије је приближно 99% мерено Сангеровим секвенцирањем након ПЦР амплификације. БОМБ, Био-Он-Магнетиц-Беадс ЦГ, цитозин-гванин динуклеотид.