Informacije

1.11: Slučaj očinstva sa elektroforezom - Biologija

1.11: Slučaj očinstva sa elektroforezom - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Циљеви учења

Ciljevi:

  • Izvršite elektroforezu u agaroznom gelu na uzorcima.
  • Naučite kako da analizirate DNK otiske prstiju.

Rezultati učenja učenika:

Po završetku ove laboratorije studenti će biti u stanju da:

  • Odvojite molekule elektroforezom.
  • Analizirajte trake nastale gel elektroforezom.
  • Odredite očinstvo potomstva pomoću analize DNK otiska prsta.

Deo I: Agarozna gel elektroforeza

Uvod

Gel elektroforeza je veoma česta i korisna tehnika za odvajanje DNK, RNK i proteinskih molekula na osnovu veličine i naelektrisanja molekula. Agaroza je polisaharid, koji se nalazi u morskim algama, koji formira gel matriks (mreža rupa različitih veličina). Kada se električna struja prođe kroz pufer i gel, molekuli u uzorku se kreću ka elektrodi sa suprotnim naelektrisanjem. Molekuli DNK, RNK i proteina obično imaju negativan ukupni naboj i kreću se prema pozitivnoj elektrodi. Manji molekuli se mogu kretati kroz matricu gela brže od većih molekula.

DNK otisak prsta koristi obrasce traka koji su rezultat specifičnog tretmana DNK uzoraka da bi se identifikovao odnos uzorka i referentnih uzoraka. U ovoj laboratoriji ćete pokrenuti simulaciju aktivnosti DNK otiska prsta kako biste se upoznali sa ovim procesom. Učitaćete uzorke na gel i odvojiti trake u svakom uzorku da biste kreirali specifične šare pomoću gel elektroforeze.

Priprema gelova agaroze

Postoje različiti aktivni puferi koji se mogu koristiti za odvajanje DNK. Nekoliko najčešće korišćenih pufera se nazivaju TAE (Tris acetat EDTA), TBE (Tris borat EDTA) i SB (natrijum borat). Uvek koristite isti pufer da napravite gel agaroze i pokrenete elektroforezu.

MATERIJALI

  • Agaroza prah
  • Spatula
  • Vaganje broda
  • 20x zaliha
  • Graduirani cilindri
  • PipetAid
  • Serološka pipeta
  • Boca sa ventiliranim poklopcem

OPREMA

  • Balans
  • mikrotalasna

ПРОЦЕДУРА

  1. Pripremite 500 ml 1X natrijum boratnog pufera iz 20X osnovnog rastvora.
    1. Izmerite 25 mL 20X natrijum-boratnog pufera u 25 mL graduisanom cilindru i sipajte u posudu od 500 mL.
    2. Izmerite 475 mL DI-vode u graduisanom cilindru od 500 mL i sipajte u isti kontejner.
    3. Čvrsto zatvorite i promešajte.
  2. Pripremite 50 ml 0,8% (w/v) agaroze u 1X puferu natrijum borata da sipate četiri Mini One gela. Imajte na umu da su agaroza (i želatin) dve supstance koje se pripremaju na poseban način, jer se mogu rastvoriti samo u tečnostima koje ključaju. Dakle, NIKADA ne stavljamo prah agaroze (i želatina) u gradirane cilindre. Umesto toga, sipamo prah u završni kontejner (Erlenmajer).
    1. Izmeriti 50 mL 1X pufera sa 50 mL graduisanim cilindrom i sipati u erlenmajer.
    2. Odmeriti 0,4 g praha agaroze i sipati u isti balon. Ovo će izgledati kao neprozirna kaša.
    3. Koristite poklopac sa ventilacijom ako je moguće (ili bez poklopca). Stavite bocu u mikrotalasnu pećnicu i uključite (na 1 minut) na visokoj temperaturi. Pažljivo pazite - ne dozvolite da tečnost proključa!
    4. Pazite na bubrenje tečnosti. Čim tečnost počne da bubri, zaustavite mikrotalasnu pećnicu, koristite rukavice ili silikonske „vruće ruke“ da zavrtite bocu 2-3 puta.
    5. Zatim zamenite i ponovo uključite mikrotalasnu pećnicu za drugo ključanje.
    6. Čim tečnost počne da bubri, zaustavite mikrotalasnu pećnicu, koristite rukavice ili „vruće ruke“ da držite bocu do plafonskog svetla. Pažljivo potražite mrlje ili kristale u tečnosti. Kada u bistrom rastvoru više nema vidljivih mrlja, onda se agaroza potpuno istopila.
    7. Stavite bocu na sto i ostavite da se ohladi na 60oC. Kada prvi put budete u mogućnosti da držite bocu golim rukama, onda je agaroza dovoljno hladna da se sipa u tacne. Nemojte sipati agarozu previše vruću, jer će se gelovi za livenje iskriviti i popucati. Ne hladite agarozu predugo, jer gel neće ravnomerno polimerizovati.
    8. Pripremite tacne za livenje i vežbajte ubacivanje uzoraka gela dok čekate.

Lijevanje agaroznih gelova (MINI ONE EMBITEC GEL SISTEM)

  1. Postavite dve prozirne akrilne posude za livenje u belo postolje za livenje.
  2. Umetnite češalj sa 9 otvora u odgovarajući otvor postolja za livenje.
  3. Najbolje je da koristite Pipet-Aid i serološku pipetu od 25 mL za merenje i prebacivanje 12,5 mL otopljenog rastvora agaroze u svaku posudu za livenje. Ili sipajte rastvor agaroze do 1/3 visine češlja.
  4. Brzo pomerajte ili iskočite vazdušne mehuriće vrhom pipete ili češljem za gel. Umetnite gel češalj u odgovarajući otvor.
  5. Ne pomerajte i ne udarajte ležište za gel dok se gel ne stvrdne za oko 15 minuta.
  6. Dodatak rastvora agaroze čuvati u boci, pokrivenom parafilmom ili poklopcem, na 4oC za kasniju upotrebu.

Vežbajte unošenje uzoraka gela

Ubacivanje uzoraka gela je veština za koju je potrebna vežba da bi se naučila! Pravi gel agaroze koji ćete koristiti za elektroforezu je veoma delikatan i lako se može probušiti. Gel za vežbanje se ne može probušiti, ali obezbeđuje otvore iste veličine za doziranje vaših uzoraka. Pošto je DNK jasna, obično se u uzorke DNK dodaje obojena boja za punjenje. Glicerol visoke gustine se takođe dodaje boji za punjenje, tako da će uzorci DNK brzo pasti na dno bunara.

Laboratorijski savet: Kada stavljate uzorke u jažice za gel, samo gurnite klip mikropipete do prvog graničnika, NEMOJTE pritiskati do drugog graničnika. Obavezno držite palac pritisnut na klip, sve dok mikropipeta potpuno ne izađe iz rezervoara za pufer.

  1. Nabavite uretanski gel za vežbanje.
  2. Pokrijte gel dejonizovanom vodom. Ako postoje mehurići u bunarima, koristite plastičnu pipetu za prenos da biste uklonili mehuriće.
  3. Koristite vrh pipete na mikropipeti P20 i podesite brojčanik na 10,0 uL.
  4. Pritisnite i držite klip mikropipete do prvog graničnika.
  5. Uzmite 10 µL crvene boje i polako otpustite palac.
  6. Držite mikropipetu vertikalno (pogledajte sliku 1) iznad gela za vežbanje, tako da je vrh ispod nivoa vode i neposredno iznad bunara. Nema potrebe da vrh ulazi u bunar, jer će teški glicerol povući uzorak na dno bunara.
  7. Gurnite klip samo do PRVOG STOP-a i držite palac tamo. (Opcionalno: pokušajte da gurnete do druge stanice da vidite šta se dešava.)
  8. Pomerite celu ruku nagore, tako da mikropipeta izađe iz vode, a zatim pustite da vam palac izađe sa klipa. (Opcionalno: pokušajte da otpustite palac dok je pipeta još uvek u vodi da vidite šta se dešava).
  9. Vežbajte ubacivanje 10,0 µL crvene boje u tri ili više udubljenja gela za vežbanje.
  10. Trebalo bi da vidite kako uzorak u boji pada na dno bunara.

Laboratorijski savet: Ako se uradi ispravno, sav uzorak će ostati u bunaru. Proverite da li postoji neka obojena boja koja pluta sa vrha bunara, što znači da uzorak može kontaminirati drugi bunar. Proverite da li boja curi sa dna bunara, što znači da ste probušili bunar i da uzorak možda neće ući u gel.

II DEO: Slučaj očinstva: Ko je otac mojih mačića?

Meri ima belu mačku po imenu „Honey“ koja je izgubljena dva dana pre otprilike tri meseca. Sada ima četiri mačića (slika 1) i Meri želi da zna da li bi dve susedne mačke, „Tom“ ili „Buč“, mogle da budu otac svakog mačića. Da bi analizirala njihov DNK otisak prsta, Meri je sakupila folikule dlake od svake odrasle mačke i mačića, ekstrahovala DNK i pojačala DNK pomoću lančane reakcije polimeraze.

Хипотеза

Koristeći fotografiju, popunite tabelu 1 svojim predviđanjem oca svakog mačića.

Tabela 1. Hipoteza o očinstvo mačića

Kitten

Potencijalni otac

Расуђивање

Крем

Melasa

Đumbir

Šećer

Materijali

Reagensi

  • Prethodno izliven 0,8% agarozni gel
  • Sedam uzoraka u epruvetama za mikrofugiranje. Po jedan za svaku mačku
  • 135-150 mL 1X natrijum-boratnog pufera (dovoljno da se potopi agarozni gel)

Oprema i zalihe

  • Sistem za elektroforezu kao što je MiniOne ili drugi brend sa gel komorom i napajanjem
  • P-20 mikropipete i odgovarajući saveti
  • Mobilni telefon ili kamera za fotografisanje gela i dokumentovanje rezultata

Процедура

  1. NAPOMENA: Sledeće je završeno kada je komora za elektroforezu pripremljena sa 0,8% agaroznog gela i 1x natrijum boratnog pufera u komori. Ne zaboravite da na odgovarajući način dokumentujete svoju proceduru u svojoj laboratorijskoj beležnici.
  2. Nabavite „uzorke DNK“ – postoji sedam epruveta za mikrofuge sa oznakom P-V.
  3. Koristeći P-20 mikropipetator i vrh pipete, izmerite 10 µL iz epruvete P i prenesite u prvi bunar agaroznog gela. Obavezno pratite redosled punjenja gela naveden u koloni 1 – Добро.
  4. Koristeći novi vrh za svaki uzorak, prenesite 10 µL svakog uzorka u nove jažice gela.
  5. Obavezno pratite učitavanje uzorka, ako ne pratite donju tabelu. Ako je bilo problema sa punjenjem (probušen gel, nema dovoljno uzorka), obavezno upišite u kolonu NAPOMENA.
Tabela 2. Učitavanje beleški: Uključite sva odstupanja ili beleške u svoju laboratorijsku beležnicu

Добро

Tube

DNK uzorak 10µL

Napomene za učitavanje

1

P

Tom (muško)

2

P

krem (mače)

3

R

melasa (mače)

4

S

med (žensko)

5

T

đumbir (mače)

6

U

šećer (mače)

7

V

Buč (muško)

  1. Ako koristite MiniOne sistem za elektroforezu, pustite gel 15 minuta, dok se trake boje ne razdvoje. Ako koristite drugi sistem za elektroforezu, pustite gel na 135 V dok se prednja strana boje ne pojavi.
  2. Za najbolji pregled rezultata, izvadite posudu za livenje (sa gelom) iz rezervoara za pufer, gurnite gel na beli laminirani papir, označite uzorke (i ime vašeg tima) i snimite fotografiju.
  3. Pošto će uzorci DNK difundovati kroz agarozne gelove, uvek treba brzo da beležite rezultate kada se elektroforeza isključi.

ANALIZA

  1. Koristite olovke u boji da snimite obrasce traka (obojite odgovarajuće blokove) u tabeli podataka ispod.
Tabela 3. Obojene „DNK“ trake razdvojene elektroforezom u agaroznom gelu

Tube

P

P

R

S

T

U

V

Трака

Tom (Мушки)

Крем

Melasa

Душо(Женско)

Đumbir

Šećer

Butch (Мушки)

Plava #1

Plava #2

Pink #1

Ljubičasta #1

Žuta #1

Žuta #2

  1. Pažljivo razmotrite svaku traku od sva četiri uzorka mačića i odredite da li bend odgovara Tomu, Honeyu ili Butchu. Za uzorke mačića (kolone QRTU) u tabeli sa podacima 3, napišite (unutar obojenih blokova) ko odgovara tom opsegu -- Tom, Honey ili Butch.
  2. Izvucite svoje zaključke na osnovu „DNK dokaza“.
  3. Popunite 2. i 3. kolonu u tabeli 4 ispod. Uporedite svoju hipotezu u tabeli 1 gde ste pogodili oca za svako mače na osnovu izgleda sa vašim zaključkom o ocu na osnovu DNK dokaza. Da li je vaša hipoteza bila tačna za svako mače?
  4. Koji su konkretni dokazi koji opravdavaju vaš zaključak o određivanju oca svakog mačića? Popunite svoje odgovore na ova pitanja u tabeli ispod.
Tabela 4. Poređenje hipoteze i zaključka potkrijepljenih eksperimentalnim dokazima

KITTEN

OTAC na osnovu vizuelnih

OTAC na osnovu DNK

Доказ

Крем

Melasa

Đumbir

Šećer

Studijska pitanja

  1. Tokom gel elektroforeze, DNK će migrirati ka kojoj elektrodi?
  2. Da imate molekule DNK koji su mali, srednji, dugi i ekstra dugi, koji bi bili najbliži dnu gela nakon elektroforeze?
  3. Šta znate o obrascu bendova koji su rezultat potomstva u odnosu na majku i oca?
  4. Ako ste izvršili analizu DNK otiska prsta, ali uzorak trake za potomstvo ne odgovara nijednom roditelju, šta biste zaključili?


Pogledajte video: SKANDAL U HRVATSKOJ ZLOSTAVLJA ME DRŽAVNA DJELATNICA POREZNE UPRAVE SPLIT KOJA IMA (Јануар 2023).